[發明專利]一種光學純R-乙偶姻的生產方法

有效

• 申請號: 201410341765.1
• 申請日: 2014-07-17
• 公開（公告）號: CN104087602B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 謝能中;黃日波;李檢秀;郭鈴;黃艷燕;杜奇石;王青艷;李億
• 申請（專利權）人: 廣西科學院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12P7/26;C12R1/19
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司45104
• 代理人: 黃永校

1.(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種光學純R-乙偶姻的生產方法，其特征在于，包括如下步驟：將所述(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh以及葡萄糖脫氫酶基因gdh在大腸桿菌中表達，并以此重組大腸桿菌休止細胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉化生產光學純R-乙偶姻。

3.如權利要求2所述生產光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，所述以重組大腸桿菌休止細胞為生物催化劑，以丁二酮為前體轉化生產光學純R-乙偶姻的方法，包括如下步驟：

(1)平板培養：將重組大腸桿菌劃線到含有質量體積比為1.5～1.8％瓊脂的并含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養；

(2)種子培養：在無菌的條件下，用牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌落，然后接種到10～100mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃搖床震蕩培養；

(3)發酵罐培養：在無菌條件下，取步驟(2)所得的菌液以體積比為1～10％的接種量接種到0.5～10L的含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃培養2～10小時，然后再加入終濃度為0.1～3mM的IPTG，10～37℃誘導2～20小時，得到一種培養物；

其中，上述步驟(1)～(3)中所述的LB培養基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，121℃條件下滅菌15分鐘；

(4)收集菌體：將步驟(3)培養得到的培養物5,000～8,000rpm離心5～15分鐘；并用生理鹽水洗滌菌體2～3遍，然后將細胞懸浮于pH6～8的緩沖液中，使細胞干重的終濃度為2～20g/L，即得到重組大腸桿菌休止細胞生物催化劑，置于4℃的冰箱中待用；

(5)轉化反應制備光學純R-乙偶姻：以細胞干重濃度為2～20g/L的生物催化劑，在10～42℃、pH5～9條件下，50～200rpm震蕩條件下對底物進行轉化，轉化初始濃度為5～25g/L的丁二酮，并加入10～100g/L的葡萄糖以補充反應所需輔酶因子的消耗；間隔補加丁二酮和葡萄糖，使反應體系中的丁二酮濃度維持在5～25g/L之間，葡萄糖濃度維持在5～50g/L之間，當R-乙偶姻的濃度不再增加時，停止轉化。

4.如權利要求3所述生產光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟(3)所述誘導溫度優選10～30℃；誘導時間優選10～20小時。

5.如權利要求3所述生產光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟(5)所述轉化反應優選細胞干重濃度為5～20g/L，在20～37℃，pH6～9條件下對丁二酮進行轉化。

6.如權利要求3所述生產光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟(5)所述初始丁二酮濃度優選10～20g/L，初始葡萄糖濃度優選20～50g/L。

7.如權利要求3所述生產光學純R-乙偶姻的方法，其特征在于，步驟(5)所述轉化反應過程中補加丁二酮和葡萄糖，丁二酮濃度優選維持在10～20g/L，葡萄糖濃度優選維持在10～50g/L。

8.(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh在光學純R-乙偶姻生產方面的應用。