[發明專利]一種冷休克蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201410340999.4
• 申請日: 2014-07-17
• 公開（公告）號: CN104131003A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 劉嘉霖;張志文
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/66;C12N15/70;C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及一種的制備方法，特別是涉及一種冷休克蛋白的制備方法。?

背景技術

現有技術表達及純化出的蛋白為包涵體，僅具有蛋白一級結構可用于抗體制作，不具有生物學活性。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種冷休克蛋白的制備方法，其制備的蛋白為可溶性表達，具有生物學活性，對神經細胞具有保護作用。?

本發明是通過下述技術方案來解決上述技術問題的：一種冷休克蛋白的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：?

步驟一，TRIzol法提取總RNA；用研缽磨碎小鼠組織樣品，每50-100mg組織加入1ml裂解液，PBS漂洗細胞后，加入1ml?TRIzol試劑，吹打混勻，移入1.5ml?EP管中，然后加入氯仿抽提，用75％的乙醇充分洗滌沉淀，離心后去上清，干燥后用DEPC水溶解，-70℃保存備用；?

步驟二，eDNA第一鏈合成于20μl反應體系中加入5μl?RNA溶液、1μl?Oligo、1μl?dNTP，65℃反應5min，迅速放冰上冷卻；再加入4μlbuffer、2μl?DTT、1μl?Rnase?inhibitor，37℃反應2min后加入1μl逆轉錄酶，37℃反應60min；80℃15min終止反應，得到cDNA；?

步驟三，于20μl反應體系中加入cDNA1μl、dNTP2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer2μl；95℃預變性5min，然后95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環，72℃?延伸10min；?

步驟四，重組載體的構建，將純化的PCR產物和pGEX-4t-1，分別以EcoR?I和Sal?I雙酶切，經割膠純化后，將目的基因和pGEX-4t-1按5∶1進行連接；反應體系10μl，另加入1μl?T₄DNA連接酶，1μl緩沖液液，置于室溫2～4小時；將連接產物轉化DH5感受態細胞，依次于冰水浴30min，42℃水浴90s及冰水浴2min；加入500μl?LB培養基，37℃振蕩培養1h；離心后取50μl培養液涂于LB+氨芐青霉素120μg/ml平板，37℃過夜培養；?

步驟五，誘導表達，挑取單個菌落5ml?LB振蕩培養過夜，180r/min，37℃；次日轉種新鮮LB培養基進行放大培養；當OD₆₀₀值達到0.6～0.7時加入IPTG，于32℃繼續培養4h；取誘導前和誘導后細菌離心12000r/min收集菌體，處理后進行10％SDS-PAGE凝膠電泳；?

步驟六，初步純化，蛋白溶液準備，將上步所得菌體加入PH＝7.2，Tris-Hcl0.1g/ML，超聲破碎，12000rpm4℃離心30min，取上清用0.22mm濾膜過濾除去雜質沉淀；蛋白溶液上陽離子結合柱，收集穿透液，將穿透液上陰離子結合柱，并用0.3mol?NaCl洗脫雜蛋白，0.6mol?NaCl收集洗脫液；穿透流出液以280nm紫外檢測；?

步驟七，高度純化。?

優選地，所述步驟七將初步純化的蛋白溶液上S200分子篩柱，PBE溶液淋洗柱體，分段收集蛋白洗脫液并取樣做SDS-page檢驗純度，將高純度組份合并，真空凍干保存。?

本發明的積極進步效果在于：本發明所制備的冷休克蛋白CIRP對神經組織細胞具有保護作用及抗凋亡作用的效果，且應用原核細胞表達，產量大，制備條件簡化的優點。?

附圖說明

圖1為本發明CIRP序列PCR擴增核酸電泳1道為maker2道為CIRP?片段大小在520bp左右的示意圖。?

圖2為本發明重組GST-CIRP表達SDS-PAGE蛋白電泳的示意圖。?

圖3為本發明陰陽離子交換柱初純重組CIRP蛋白SDS-PAGE蛋白電泳的示意圖。?

圖4為本發明收集蛋白洗脫液并取樣做SDS-page檢驗純度的示意圖。?

具體實施方式

下面結合附圖給出本發明較佳實施例，以詳細說明本發明的技術方案。?

本發明冷休克蛋白的制備方法包括以下步驟：?

步驟一，TRIzol法提取總RNA；用研缽磨碎小鼠組織樣品，每50-100mg組織加入1ml裂解液，PBS漂洗細胞后，加入1ml?TRIzol試劑，吹打混勻，移入1.5ml?EP管中，然后加入氯仿抽提，用75％的乙醇充分洗滌沉淀，離心后去上清，干燥后用DEPC水溶解，-70℃保存備用。?