[發(fā)明專利]一種冷休克蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410340999.4
• 申請日: 2014-07-17
• 公開（公告）號: CN104131003A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉嘉霖;張志文
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/66;C12N15/70;C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種冷休克蛋白的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：

步驟一，TRIzol法提取總RNA；用研缽磨碎小鼠組織樣品，每50-100mg組織加入1ml裂解液，PBS漂洗細(xì)胞后，加入1ml?TRIzol試劑，吹打混勻，移入1.5ml?EP管中，然后加入氯仿抽提，用75％的乙醇充分洗滌沉淀，離心后去上清，干燥后用DEPC水溶解，-70℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，cDNA第一鏈合成于20μl反應(yīng)體系中加入5μl?RNA溶液、1μl?Oligo、1μl?dNTP，65℃反應(yīng)5min，迅速放冰上冷卻；再加入4μlbuffer、2μl?DTT、1μl?Rnase?inhibitor，37℃反應(yīng)2min后加入1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃反應(yīng)60min；80℃15min終止反應(yīng)，得到cDNA；

步驟三，于20μl反應(yīng)體系中加入cDNA1μl、dNTP2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer2μl；95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

步驟四，重組載體的構(gòu)建，將純化的PCR產(chǎn)物和pGEX-4t-1，分別以EcoR?I和Sal?I雙酶切，經(jīng)割膠純化后，將目的基因和pGEX-4t-1按5∶1進(jìn)行連接；反應(yīng)體系10μl，另加入1μl?T₄DNA連接酶，1μl緩沖液液，置于室溫2～4小時(shí)；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，依次于冰水浴30min，42℃水浴90s及冰水浴2min；加入500μl?LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；離心后取50μl培養(yǎng)液涂于LB+氨芐青霉素120μg/ml平板，37℃過夜培養(yǎng)；

步驟五，誘導(dǎo)表達(dá)，挑取單個(gè)菌落5ml?LB振蕩培養(yǎng)過夜，180r/min，37℃；次日轉(zhuǎn)種新鮮LB培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)；當(dāng)OD₆₀₀值達(dá)到0.6～0.7時(shí)加入IPTG，于32℃繼續(xù)培養(yǎng)4h；取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后細(xì)菌離心12000r/min收集菌體，處理后進(jìn)行10％SDS-PAGE凝膠電泳；

步驟六，初步純化，蛋白溶液準(zhǔn)備，將上步所得菌體加入PH＝7.2，Tris-Hcl0.1g/ML，超聲破碎，12000rpm4℃離心30min，取上清用0.22mm濾膜過濾除去雜質(zhì)沉淀；蛋白溶液上陽離子結(jié)合柱，收集穿透液，將穿透液上陰離子結(jié)合柱，并用0.3mol?NaCl洗脫雜蛋白，0.6mol?NaCl收集洗脫液；穿透流出液以280nm紫外檢測；

步驟七，高度純化。

2.如權(quán)利要求1所述的冷休克蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟七將初步純化的蛋白溶液上S200分子篩柱，PBE溶液淋洗柱體，分段收集蛋白洗脫液并取樣做SDS-page檢驗(yàn)純度，將高純度組份合并，真空凍干保存。