[發明專利]用于用動物細胞大量生產源自外源基因的蛋白質的表達載體及其應用

在審

• 申請號: 201410339039.6
• 申請日: 2009-12-22
• 公開（公告）號: CN104342454A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 田原寬;鈴木祐介;山本啟一;北原讓;鈴木定彥
• 申請（專利權）人: 國立大學法人北海道大學;扶桑藥品工業株式會社
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所(普通合伙) 11216
• 代理人: 劉激揚

本發明是2009年12月22日申請的發明名稱為“用于用動物細胞大量生產源自外源基因的蛋白質的表達載體及其應用”的第200980157244.8號發明專利申請的分案申請。?

技術領域

本發明涉及能賦予哺乳動物宿主細胞以生產高水平的源自外源基因的蛋白質能力的哺乳動物細胞表達載體。本發明的表達載體尤其適用于生產哺乳動物蛋白質，該蛋白質需要哺乳動物獨有的糖基化和折疊，而當通過使用大腸桿菌或酵母菌作為宿主的基因重組來生產時很難具有足夠活性。?

背景技術

已經開發了大量用于生產重組蛋白的載體，并且蛋白質的表達水平在使用細菌例如大腸桿菌、真核微生物例如酵母菌和昆蟲細胞作為宿主的表達體系里都很高。然而，當表達哺乳動物獨有的蛋白質時，可能不會形成常規的三維結構，并且大多數時候會遇到翻譯后修飾例如糖基化的問題。因而，需要建立使用哺乳動物細胞作為宿主的表達體系，但是通常來說，大多數情況下表達水平很低。此外，使用重組病毒載體的表達系統也用于動物細胞，其水平高于昆蟲細胞，但是從所表達的蛋白質中移除重組病毒載體是一個很麻煩的過程，并且病毒載體自身的危險性也是不可否?認的。?

用哺乳動物細胞作為宿主來生產重組蛋白的實例包括組織纖溶酶原激活因子(專利文件1)、促紅細胞生成素(專利文件2和非專利文件1-3)、IFN-γ(非專利文件4)和IFN-β(專利文件3和非專利文件5)。此外，還有很多關于重組生產單克隆抗體的報道(專利文件4-6和非專利文件6-8)。另外，哺乳動物細胞的高表達載體的一個實例是pNOW/CMV-AA(專利文件7)。用該載體生產共凝集素的生產水平在培養4天之后達到11.8μg/mL。但是，這些實例中的重組蛋白的生產水平都還不夠。?

本申請的發明涉及的現有技術文件列舉如下。?

[現有技術文件]?

[專利文件]?

[專利文件1]日本特開昭59-183693號公報?

[專利文件2]日本特開2002-45191號公報?

[專利文件3]日本特開平07-265084號公報?

[專利文件4]日本特開平07-67648號公報?

[專利文件5]日本特開平06-30788號公報?

[專利文件6]日本特開平06-217786號公報?

[專利文件7]日本特開平10-179169號公報?

[非專利文件]?

[非專利文件1]Fermentation?Bioengineering,(1989)4:257頁?

[非專利文件2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1986)83:6465頁?

[非專利文件3]Biotechnology,(1988)6:67頁?

[非專利文件4]Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1983)80:4564頁?

[非專利文件5]Cytotechnology,(1990)4:173頁?

[非專利文件6]Biotechnology,(1992)10:169頁?

[非專利文件7]J.Immunol.Methods,(1989)125:191頁?

[非專利文件8]Biotechnology,(1992)10:1455頁?

發明內容

哺乳動物細胞，尤其是中國倉鼠卵巢細胞(下文中稱為CHO細胞)在藥物制劑的生產中的應用，已經被證實是安全的并且現在已經成為常規技術。在使用哺乳動物細胞來生產重組蛋白時，提高生產力對降低成本、醫療保健成本控制等等來說都是非常重要的。因此，有需要通過有效基因轉移來發展用于生產具有高水平生產能力的轉化體的表達載體。?

有效基因轉移對哺乳動物細胞內重組蛋白的高水平的簡易生產是必需的。有效基因轉移是指不管克隆選擇容易與否，獲得具有高水平生產力的克隆的概率都很高。特別地，其是指活細胞克隆的數量相對于所有轉化的細胞在藥物選擇之后相對較小，從而很容易選擇具有高水平生產力的克隆。其也指出現具有高水平生產力的克隆的概率足夠高，即使生產目的蛋白質的細胞的數量很小。由于可利用細胞的數量變得很大，需要更多時間和精力用于選擇，并導致效率低下，并且有很高可能性會忽略潛在的具有高水平生產能力的克隆。?