[發明專利]用于用動物細胞大量生產源自外源基因的蛋白質的表達載體及其應用

在審

• 申請號: 201410339039.6
• 申請日: 2009-12-22
• 公開（公告）號: CN104342454A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 田原寬;鈴木祐介;山本啟一;北原讓;鈴木定彥
• 申請（專利權）人: 國立大學法人北海道大學;扶桑藥品工業株式會社
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所(普通合伙) 11216
• 代理人: 劉激揚

1.一種能夠在哺乳動物宿主細胞內高水平生產源自外源基因的蛋白質的表達載體，包含：

(a)翻譯弱化的二氫葉酸還原酶基因盒(翻譯弱化的DHFR基因盒)，其表達通過改變密碼子為哺乳動物中最不常用的密碼子而被弱化，其中所述翻譯弱化的DHFR基因盒的密碼子被改變為：丙氨酸為GCA，精氨酸為CGA，天冬酰胺為AAU，天冬氨酸為GAU，半胱氨酸為UGU，谷氨酰胺為CAA，谷氨酸為GAA，甘氨酸為GGU，組氨酸為CAU，亮氨酸為UUA，賴氨酸為AAA，脯氨酸為CCA，苯丙氨酸為UUU，絲氨酸為UCA，蘇氨酸為ACU，酪氨酸為UAU，和/或纈氨酸為GUA，其中所述翻譯弱化的DHFR基因盒的密碼子改變區域是所述基因盒的全長的30％或更多；和

(b)基因盒，包含用于將外源基因整合進高轉錄活性啟動子和高穩定性聚腺苷化信號之間的克隆位點。

2.權利要求1所述的表達載體，其中所述翻譯弱化的DHFR基因盒使用具有低表達誘導活性的啟動子作為啟動子。

3.權利要求2所述的表達載體，其中所使用的低活性啟動子是源自在哺乳動物細胞內幾乎不表達的基因的啟動子、或者是去除了增強子部分的啟動子。

4.一種生產能夠高水平生產源自外源基因的蛋白質的轉化體的方法，包含將外源基因插入到權利要求1-3任一項所述的表達載體中的步驟和用所述表達載體轉化二氫葉酸還原酶基因缺失的宿主細胞的步驟。

5.一種生產源自外源基因的蛋白質的方法，包含如下步驟：

(a)將外源基因插入至權利要求1-3任一項所述的表達載體中；

(b)用所述表達載體轉化二氫葉酸還原酶基因缺失的宿主細胞；

(c)在不含次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培養基中培養轉化體；和

(d)從培養的轉化體收集源自外源基因的蛋白質。

6.權利要求5的生產方法，其中在權利要求5的培養步驟(c)中使用化學成分確定培養基(CD培養基)或添加了非動物基的添加劑的CD培養基。

7.一種篩選具有高水平生產外源基因的蛋白質的能力的轉化體的方法，包含如下步驟：

(a)將外源基因插入至權利要求1-3任一項所述的表達載體中；

(b)用所述表達載體轉化二氫葉酸還原酶基因缺失的宿主細胞；和

(c)在不含次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培養基中培養轉化體。