[發(fā)明專利]高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410336950.1
• 申請日: 2014-07-16
• 公開（公告）號: CN104059872B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙黎明;邱勇雋;王耀松;夏泉鳴;蔣麗華;范立強(qiáng);周家春
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責(zé)任公司31203
• 代理人: 李鴻儒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。通常以beta-1,4-糖苷鍵聚合成幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)是自然界中數(shù)量僅次于纖維素的第二大類碳水化合物，存在于低等植物菌類、藻類的細(xì)胞，節(jié)肢動物蝦、蟹、昆蟲的外殼，高等植物的細(xì)胞壁等。除了作為幾丁質(zhì)的組分，N-乙酰氨基葡萄糖還與N-乙酰胞壁酸通過多肽相互交聯(lián)，構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)-肽聚糖，也與D-葡萄糖醛酸形成重復(fù)的二糖單位而構(gòu)成透明質(zhì)酸。

N-乙酰氨基葡萄糖醫(yī)藥上作為抗菌消炎藥物，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥和治療胃潰瘍疾病，若與抗生素一起使用，可促進(jìn)抗生素在血液中的吸收，降低副反應(yīng)同時也可抑制癌細(xì)胞的生長，是合成新型抗癌藥物氯脲霉素的主要原料。食品方面，N-乙酰氨基葡萄糖是嬰兒配方乳中添加的一種重要微量糖類成分，也是合成VB₆和核黃素中間體的起始原料。此外，還可應(yīng)用于化妝品和飼料添加劑中，用途十分廣泛。

N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)目前主要是利用氨基葡萄糖和乙酸酐經(jīng)化學(xué)縮合反應(yīng)而成，存在成本過高、收率低、純度不足等缺陷。因此，國內(nèi)外開展了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的工作。

美國阿基昂生命科學(xué)公司(Arkion Life Sciences LLC)利用代謝工程構(gòu)建了一系列代謝工程菌，通過優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，獲得了高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)工藝(WO2004003175，US7332304和CN101365785A等)，該專利中，通過向大腸桿菌引入并過表達(dá)6-磷酸氨基葡萄糖乙?；?，敲除N-乙酰氨基葡萄糖消耗基因，打通葡萄糖到氨基葡萄糖的代謝途徑，構(gòu)建了高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌。中國專利申請?zhí)?01110174246.7(CN102286420A)和201110174249.0(CN102268399A)通過上述類似的方式，構(gòu)建了兩株N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)菌株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，本發(fā)明的另一目的在于提供該工程菌的構(gòu)建方法，以及在生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過構(gòu)建新的高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程大腸桿菌，提高了N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的產(chǎn)(高產(chǎn))N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，是通過將高表達(dá)編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因(如neuC1基因)和高表達(dá)編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因(如glmS基因)導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)，并敲除大腸桿菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代謝途徑酶的基因(如基因簇nagDCABE)構(gòu)建而成的重組大腸桿菌。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因來源于空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或能表達(dá)相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據(jù)GenBank No.AF400048基因序列全基因合成，或利用空腸彎曲菌(如菌株ATCC43438)的基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來源于大腸桿菌或能表達(dá)相同功能酶的微生物，6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的獲得可根據(jù)GenBank No.NC_007779的大腸桿菌W3110基因組序列，經(jīng)全基因合成得到，或利用大腸桿菌基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)氪竽c桿菌表達(dá)，是將這兩個基因克隆到表達(dá)載體上后，以質(zhì)粒的方式在大腸桿菌中表達(dá)，或?qū)蓚€基因整合到大腸桿菌染色體上表達(dá)。

上述高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟包括：敲除大腸桿菌中的nagDCABE基因簇，將neuC1和glmS基因分別克隆到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入敲除了nagDCABE基因簇的大腸桿菌中，獲得高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌。其中，該構(gòu)建方法，更加具體的步驟包括：

A、敲除大腸桿菌中的基因簇nagDCABE，獲得基因簇nagDCABE失活的菌株；

B、全基因合成編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶的neuC1基因(SEQ ID NO.5)，并克隆表達(dá)載體；