[發明專利]高產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410336950.1
• 申請日: 2014-07-16
• 公開（公告）號: CN104059872B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 趙黎明;邱勇雋;王耀松;夏泉鳴;蔣麗華;范立強;周家春
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責任公司31203
• 代理人: 李鴻儒

1.一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，其特征在于：所述的工程菌是通過將編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶基因和編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因導入大腸桿菌表達，并敲除大腸桿菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代謝途徑酶的基因構建而成的重組大腸桿菌。

2.根據權利要求1所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，其特征在于：所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶基因來源于空腸彎曲菌Campylobacter jejun或能表達相同功能酶的微生物。

3.根據權利要求2所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，其特征在于：所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶基因是根據GenBank No.AF400048基因序列全基因合成，或利用空腸彎曲菌的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得。

4.根據權利要求1所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來源于大腸桿菌，或具有相同功能酶的微生物。

5.根據權利要求4所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的獲得是根據GenBank No.NC_007779的大腸桿菌W3110基因組序列，經全基因合成，或利用大腸桿菌基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得。

6.根據權利要求1所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌，其特征在于：是將如SEQ ID NO.5所示的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶的neuC1基因和如SEQ ID NO.8所示的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因克隆直接整合到敲除N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代謝途徑酶的基因nagDCABE的大腸桿菌染色體上表達；或兩個基因通過表達載體轉化入敲除N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代謝途徑酶的基因nagDCABE的大腸桿菌中表達。

7.一種如權利要求1所述的產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌的構建方法，其特征在于，該方法包括步驟：

A、敲除大腸桿菌中的基因簇nagDCABE，獲得基因簇nagDCABE失活的菌株；

B、全基因合成編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構酶的neuC1基因如SEQ ID NO.5所示，并克隆表達載體；

C、以大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增獲得編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因如SEQ ID NO.8所示，克隆至步驟B獲得的表達載體上，獲得雙基因表達載體；

D、將步驟C獲得的雙基因表達載體轉化入步驟A所得的菌株中，獲得第一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌；或

將步驟C獲得的雙基因表達載體整合至步驟C所得菌株的染色體上，獲得第二種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌。

8.根據權利要求7所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌的構建方法，其特征在于，所述步驟B中，表達載體為質粒pETDuet-1。

9.根據權利要求7所述的一種產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌的構建方法，其特征在于，所述步驟D中，整合是通過RED重組系統，利用pKD46質粒表達RED重組酶來實現。

10.一種如權利要求1至6任一所述的產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌在生產N-乙酰氨基葡萄糖中的應用，其特征在于，生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法包括：

1)挑取產N-乙酰氨基葡萄糖代謝工程菌的單菌落于種子培養基中，在30～40℃好氣培養12～20小時；其中，種子能多級放大培養；

2)將培養好的種子接種于含有發酵培養基的發酵罐中，在30～40℃發酵培養，攪拌速度300～800轉/分鐘，通風培養，用氨水控制發酵過程pH6～8；

3)培養至菌體濃度OD₆₀₀為25～30時，加入終濃度為0.05～1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，30～40℃繼續培養，至結束發酵；

所述的種子培養基和發酵培養基的配方如下：

氮源，0.1-10g/L，磷源0.1-25g/L，葡萄糖1-100g/L，微量元素0.01-50mg/L。