[發明專利]一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法

無效

• 申請號: 201410334972.4
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104131088A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 胡海龍;孫巖;陳濤;謝林國
• 申請（專利權）人: 天津市泌尿外科研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/864;G01N33/68;A61K49/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，該E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法包括：

步驟一，通過收集不同前列腺癌石蠟標本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫組化，分析E2F3及其所調基因在前列腺癌中的表達情況；

步驟二，建立以AVV為載體的RNAi平臺，并分析干擾序列對前列腺癌LNCaP細胞中E2F3基因沉默的影響；

步驟三，并經體外實驗證實E2F3基因沉默對LNCaP細胞中E2F3及相關調控基因的影響及對細胞增殖及凋亡的影響；應用裸鼠進行原位前列腺癌動物模型的構建；

步驟四，應用AAV干擾載體進行腫瘤的局部注射后明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質水平的表達情況及對腫瘤生長抑制情況，最后應用實時定量PCR進行全血E2F3mRNA的檢測，明確作為前列腺癌腫瘤標記物的可能性。

2.如權利要求1所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，該E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法具體包括以下步驟：

第一步，取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預后之間的關系，根據Gleason分級和評分標準進行病理分級并根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期；

第二步，合成三對針對于E2F3基因的siRNA對應模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的干擾片段；根據篩選結果，將相應shRNA表達框克隆到腺相關病毒載體中，包裝純化病毒后，轉染膀胱移行細胞癌腫瘤細胞株，檢測病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細胞增殖凋亡相關指標；

第三步，采用LNCaP細胞在裸鼠前列腺前頁進行接種，建立原位前列腺癌動物模型。

3.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，取不同臨床分期、病理分級的前列腺癌石蠟切片組織進行免疫組化染色，在蛋白質水平研究E2F3及AR的表達情況及二者的表達與前列腺癌臨床特點及預后之間的關系；根據Gleason分級和評分標準進行病理分級并根據Whitmore-Jewett系統進行臨床分期。

4.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，針對E2F3的AAV干擾穿梭質粒的構建及病毒的包裝、濃縮與純化包括以下步驟：

步驟一，對已制備的E2F3RNAi質粒載體進行雙酶切，插入干擾片斷后，將U6-RiE2F3序列PCR后克隆進T載體，然后亞克隆至pAAV-MCS；酶切、PCR、測序驗證載體構建成功并證明ITR的存在；

步驟二，待AAV-293細胞達到70％-80％融合后，分別將干擾穿梭質粒與pRC、pHelper按照1：1：1濃度與細胞電轉，24小時后收集細胞；

步驟三，采用氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三個步驟分離、濃縮、純化病毒；

步驟四，應用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測病毒純度；將純化的病毒經鎢酸鹽染色后，置于150目的鎳網上，掃描電鏡觀察。

5.如權利要求2所述的E2F3基因沉默對前列腺癌動物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，含有干擾序列的rAAV對E2F3及相關調控基因表達影響的方法包括：

步驟一，對LNCaP細胞進行病毒轉染，通過綠色熒光的觀察、重組病毒載體與質粒載體在轉化效率、沉默效率、細胞毒性；

步驟二，rAAV干擾載體對LNCaP細胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質表達水平的影響；

步驟三，接種LNCaP細胞于24孔板中，待細胞80-90％融合，棄培養液，并向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察干擾效果，不同濃度及不同作用時間的rAAV-RiE2F3干擾載體對LNCaP細胞中E2F3沉默的影響及細胞殺傷作用；

步驟四，應用流式細胞術研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉染前后LNCaP細胞細胞周期及凋亡的變化情況。