[發明專利]豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法

在審

• 申請號: 201410334944.2
• 申請日: 2014-07-15
• 公開（公告）號: CN104099364A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 周必英
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗人工傳代后和不同保存條件下的穩定性。

背景技術

豬囊尾蚴病是由豬帶絳蟲(Taenia?solium)?的中絳期幼蟲豬囊尾蚴寄生于人或豬等引起的一種嚴重危害人類健康和畜牧業生產的人獸共患寄生蟲病。我國是高發國家之一，豬囊尾蚴可寄生于人體皮下、肌肉、腦、眼等不同部位，其中腦囊蟲病致殘率、致死率均較高。該病防治存在化學藥物的殘留和抗藥性問題，隨著分子生物學技術的發展，研制疫苗防治該病已成為當前研究的熱點。

TSO45W-4B和TSOL18是豬帶絳蟲六鉤蚴階段特異性表達抗原，具有良好的免疫原性和免疫保護性，是理想的豬帶絳蟲疫苗候選抗原。重組活載體疫苗是指將編碼外源性抗原的基因引入特定的疫苗載體，構建成能表達相應抗原而且傳遞至宿主免疫系統引起相應免疫應答的疫苗。雙歧桿菌(Bifidobacterium,Bb)是人和哺乳動物腸道重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫調節和營養等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術的發展，選擇具有益生功能的Bb作為載體傳遞系統，已在細菌、病毒、寄生蟲、腫瘤等領域構建了一系列重組雙歧桿菌。

然而，疫苗的穩定性是考核疫苗質量的關鍵，直接關系到疫苗的質量及生產成本，其研究目的是為證明疫苗產品在某種保存條件下，保存某一段時間后仍然具備可接受的質量、有效性和安全性提供科學依據。同時，傳代培養后Bb所攜帶的外源重組質粒穩定存在有助于在體內表達足夠的抗原蛋白,?經抗原提呈后產生免疫應答。而在豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性研究方面，尚未見相關報道，因此，本研究擬分別使用豬帶絳蟲重組質粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.longum），獲得陽性菌株，進一步研究其人工傳代后和不同保存條件下的穩定性，為豬囊尾蚴病疫苗的研發奠定基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：分別使用重組質粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18轉化長雙歧桿菌(B.longum)，將獲得的陽性菌株傳代培養，抽提質粒，使用PCR擴增TSO45W-4B/TSOL18/TSO45W-4B-TSOL18片段，檢測其轉化后目的基因質粒的穩定性。同時，將獲得的陽性菌株分別分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質粒，電泳鑒定，檢測菌株質粒是否丟失，從而判斷其穩定性。

本發明的技術方案是：豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩定性的研究方法，包括以下步驟：

（1）重組質粒電轉化B.longum：分別將豬帶絳蟲重組質粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18與B.longum感受態細菌混勻，冰浴后轉移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中厭氧培養；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養；?

（2）陽性菌株的PCR鑒定：挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS液體培養基的EP管中，厭氧培養；將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴；抽提質粒為模板，進行PCR鑒定；

（3）陽性菌株傳代培養的穩定性或陽性菌株不同保存條件的穩定性：取上述鑒定的陽性菌株在MRS培養基中傳代，每次傳代抽提質粒為模板，進行PCR鑒定；或將上述鑒定的陽性菌株分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質粒，進行電泳鑒定。

所述的電擊參數設置為：電壓1.25KV、場強12.5?KV/cm、電容25μF、電阻200Ω、轉化時間5ms。

pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18分別能在宿主菌B.longum中穩定遺傳7代、6代和9代。

陽性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在-20℃、-80℃、液氮中保存穩定，保存期限2個月。

本發明達到的有益效果：