[發明專利]植物基因組定點修飾方法

有效

• 申請號: 201410334460.8
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104293828B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 朱健康;毛妍斐;馮爭艷;張波濤
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 馬莉華,崔佳佳

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及RNA引導的植物基因組定點修飾方法。

背景技術

過去十多年里，序列特異性核酸酶的發明和改進已經在創建定點突變方面展現出了強大威力。鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALENs)即是其中的主要代表(Carroll et al.,2006；Christian et al.,2010)。它們是識別一段特定核酸序列的結合結構域陣列與一種非特異性核酸酶Fok1組成的融合蛋白。這些蛋白切割核酸序列產生雙鏈斷裂以后，生物體會通過非同源末端連接或者同源重組兩種機制進行修復，從而引入定點改變或修飾。上述技術已經在多個物種里獲得成功應用，包括線蟲，人細胞，老鼠，斑馬魚，玉米，水稻，短柄草等(Beumer et al.,2006；Meng et al.,2008；Shukla et al.,2009；Meyer et al.,2010；Cui et al.,2011；Mahfouz et al.,2011；Li et al.,2012；Meyer et al.,2012；Shan et al.,2013；Weinthal et al.,2013)。然而，這些技術的最大缺陷是通過蛋白元件來識別特定核酸序列，構建比較麻煩，識別特異性有待提高。

2012年人們發現并改進了一種突破性的新技術，CRISPR/Cas。CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)，是一段被一種短重復序列分隔的核酸序列，它們轉錄形成的CRISPR RNA(crRNAs)與另一種反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)部分區域配對形成二元復合體。然后，該二元復合體一起引導具有非特異核酸酶活性的Cas蛋白，切割與crRNAs匹配的DNA序列，從而形成雙鏈斷裂。

此外，人們進一步將crRNAs與tracrRNA融合在一起，形成單一的chimeric RNA(chiRNA)分子，并發現chiRNA同樣能介導Cas9蛋白切割目的序列(Jinek et al.,2012)。這種可編輯型CRISPR/Cas系統很快在多個物種里面取得成功應用，包括人細胞系，斑馬魚，大腸桿菌和老鼠等(Jinek et al.,2012；Hwang et al.,2013；Jiang et al.,2013；Jinek et al.,2013；Mali et al.,2013；Shen et al.,2013；Wang et al.,2013)。這項技術的最大優勢是構建簡易，而且可以同時對多個目標位點基因修飾。對于動物，可將chiRNA和Cas9的體外轉錄產物直接施用(如通過注射)于動物，從而引起基因突變。在老鼠中，已有同時對多達5個目標位點基因突變的成功報道。然而，由于種種未知的原因，目前尚未在植物中成功開發和應用類似的技術。

綜上所述，為了植物基因工程的需要，本領域迫切需要開發簡便高效的植物基因組的定點修飾方法。

發明內容

本發明的目的就是簡便高效的植物基因組的定點修飾方法。

本發明的另一目的是提供適用于植物的CRISPR/Cas技術，并在穩定植株中實現特異DNA序列的切割。

在本發明的第一方面，提供了一種植物基因組定點修飾方法，包括步驟：

(a)將一表達嵌合RNA和Cas蛋白的核酸構建物導入植物細胞，獲得轉化的植物細胞，其中所述嵌合RNA是由特異性識別待定點修飾(或待切割位點)的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所構成的嵌合體(chimera)；和

(b)在合適的條件下，使轉化的植物細胞中的所述核酸構建物轉錄形成嵌合RNA(chiRNA)，并且使所述轉化的植物細胞表達所述的Cas蛋白，從而使得在所述嵌合RNA的引導下，在所述轉化的植物細胞中，通過所述Cas蛋白對基因組DNA進行定點切割，從而進行基因組定點修飾。

在另一優選例中，所述的定點修飾包括定點隨機修飾和定點非隨機修飾(定點精確修飾)。