[發(fā)明專利]植物基因組定點(diǎn)修飾方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410334460.8
• 申請(qǐng)日: 2014-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN104293828B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱健康;毛妍斐;馮爭(zhēng)艷;張波濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31266
• 代理人: 馬莉華,崔佳佳

1.一種植物基因組定點(diǎn)修飾方法，其特征在于，包括步驟：

(a)將一表達(dá)嵌合RNA和Cas蛋白的核酸構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述嵌合RNA是由特異性識(shí)別待定點(diǎn)修飾的CRISPR RNA和反式作用型CRISPR RNA所構(gòu)成的嵌合體；和

(b)在合適的條件下，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的所述核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄形成嵌合RNA，并且使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞表達(dá)所述的Cas蛋白，從而使得在所述嵌合RNA的引導(dǎo)下，在所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，通過所述Cas蛋白對(duì)基因組DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，從而進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾，其中所述核酸構(gòu)建物包括第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物，其中第一亞核酸構(gòu)建物和第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體的；

其中，第一亞核酸構(gòu)建物包括從5'至3'的以下元件：

第一植物啟動(dòng)子；

與所述第一植物啟動(dòng)子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼序列的結(jié)構(gòu)如式I所示：

A-B (I)

式中，

A為編碼CRISPR RNA的DNA序列；

B為編碼反式作用型CRISPR RNA的DNA序列；

“-”表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉(zhuǎn)錄形成一個(gè)完整的RNA分子，即嵌合RNA；和

RNA轉(zhuǎn)錄終止子；

第二亞核酸構(gòu)建物包括5'至3'的以下元件:

第二植物啟動(dòng)子；

與所述第二植物啟動(dòng)子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或兩側(cè)與核定位序列融合的融合蛋白；和

植物轉(zhuǎn)錄終止子；

其中，所述的第一植物啟動(dòng)子選自下組：AtU6-26、OsU6-2或其組合，并且所述的第二植物啟動(dòng)子和與所述Cas蛋白的編碼序列之間5'至3'還操作性相連有：

第三亞核酸構(gòu)建物，其中，所述的第三亞核酸構(gòu)建物為來源于番茄矮壯病毒的p19蛋白編碼序列；和

自剪切序列，其中，所述的自剪切序列為2A多肽編碼序列。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亞核酸構(gòu)建物的數(shù)量為一個(gè)或者多個(gè)，并與第二亞核酸構(gòu)建物是相互獨(dú)立的，或是一體的。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述定點(diǎn)修飾包括：

(i)在沒有供體DNA的情況下，對(duì)植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)插入和缺失；和

(ii)在存在供體DNA的情況下，以供體DNA為模板，對(duì)植物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精確插入、缺失或者替換DNA序列。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述定點(diǎn)修飾包括對(duì)植物基因組的基因敲除，基因敲入以及調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)水平。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物選自下組：?jiǎn)巫尤~植物、雙子葉植物、裸子植物、或其組合。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物選自下組：林業(yè)植物、農(nóng)用植物、或其組合。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的林業(yè)植物包括觀賞植物。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的農(nóng)用植物包括經(jīng)濟(jì)作物。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一植物啟動(dòng)子為RNA聚合酶III依賴的啟動(dòng)子。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二植物啟動(dòng)子為RNA聚合酶II依賴的啟動(dòng)子。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二植物啟動(dòng)子包括組成型表達(dá)的啟動(dòng)子或擬南芥生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的SPL啟動(dòng)子。

12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：檢測(cè)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中基因組的突變或修飾情況。