[發明專利]植物基因組定點修飾方法

有效

• 申請號: 201410334460.8
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104293828B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 朱健康;毛妍斐;馮爭艷;張波濤
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 馬莉華,崔佳佳

1.一種植物基因組定點修飾方法，其特征在于，包括步驟：

(a)將一表達嵌合RNA和Cas蛋白的核酸構建物導入植物細胞，獲得轉化的植物細胞，其中所述嵌合RNA是由特異性識別待定點修飾的CRISPR RNA和反式作用型CRISPR RNA所構成的嵌合體；和

(b)在合適的條件下，使轉化的植物細胞中的所述核酸構建物轉錄形成嵌合RNA，并且使所述轉化的植物細胞表達所述的Cas蛋白，從而使得在所述嵌合RNA的引導下，在所述轉化的植物細胞中，通過所述Cas蛋白對基因組DNA進行定點切割，從而進行基因組定點修飾，其中所述核酸構建物包括第一亞核酸構建物和第二亞核酸構建物，其中第一亞核酸構建物和第二亞核酸構建物是相互獨立的，或是一體的；

其中，第一亞核酸構建物包括從5'至3'的以下元件：

第一植物啟動子；

與所述第一植物啟動子操作性相連的嵌合RNA的編碼序列，所述嵌合RNA的編碼序列的結構如式I所示：

A-B (I)

式中，

A為編碼CRISPR RNA的DNA序列；

B為編碼反式作用型CRISPR RNA的DNA序列；

“-”表示A和B之間的連接鍵或連接序列；其中，由所述嵌合RNA的編碼序列轉錄形成一個完整的RNA分子，即嵌合RNA；和

RNA轉錄終止子；

第二亞核酸構建物包括5'至3'的以下元件:

第二植物啟動子；

與所述第二植物啟動子操作性相連的Cas蛋白的編碼序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或兩側與核定位序列融合的融合蛋白；和

植物轉錄終止子；

其中，所述的第一植物啟動子選自下組：AtU6-26、OsU6-2或其組合，并且所述的第二植物啟動子和與所述Cas蛋白的編碼序列之間5'至3'還操作性相連有：

第三亞核酸構建物，其中，所述的第三亞核酸構建物為來源于番茄矮壯病毒的p19蛋白編碼序列；和

自剪切序列，其中，所述的自剪切序列為2A多肽編碼序列。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亞核酸構建物的數量為一個或者多個，并與第二亞核酸構建物是相互獨立的，或是一體的。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述定點修飾包括：

(i)在沒有供體DNA的情況下，對植物基因組特定位點進行隨機插入和缺失；和

(ii)在存在供體DNA的情況下，以供體DNA為模板，對植物基因組特定位點進行精確插入、缺失或者替換DNA序列。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述定點修飾包括對植物基因組的基因敲除，基因敲入以及調控內源基因的表達水平。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物選自下組：單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物、或其組合。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物選自下組：林業植物、農用植物、或其組合。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的林業植物包括觀賞植物。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的農用植物包括經濟作物。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一植物啟動子為RNA聚合酶III依賴的啟動子。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二植物啟動子為RNA聚合酶II依賴的啟動子。

11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二植物啟動子包括組成型表達的啟動子或擬南芥生殖細胞特異性表達的SPL啟動子。

12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：檢測所述轉化的植物細胞中基因組的突變或修飾情況。