[發明專利]一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法

有效

• 申請號: 201410334259.X
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104122355B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 王雪;劉可春;韓利文;陳錫強;何秋霞;彭維兵;王希敏;侯海榮;張云;孫晨;楚杰
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生物研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法，屬于毒理學檢測領域。

背景技術

腎臟是機體的重要器官，能排出體內代謝產物及某些廢物、毒物，調節機體水、電解質平衡，保證機體內環境的穩定。作為機體的主要排泄器官，腎臟極易受到體內各種代謝廢物、毒物的影響，這些物質往往具有潛在的腎臟毒性。隨著社會發展，金屬、冶煉業、化工企業增多，加之醫藥及各種農藥的濫用，環境污染日益加重，人群接觸腎毒性物質的機會增加，中毒性腎病的發病率大幅增長。臨床上腎毒物質導致的腎臟損傷，常表現為急性腎功能衰竭(acute?renal?failure,ARF)，約占急性腎衰的5～25％。急性腎衰起病兇險，死亡率高，患者多需要終身進行透析治療甚至換腎，給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和沉重的經濟負擔。因此，確立快速、有效的評價體系或評價方法來檢測化合物的腎臟毒性作用，對中毒性腎臟損害的早期預防具有顯著意義。

目前已有的關于化合物腎臟毒性方面的研究多以大鼠、小鼠、家兔等哺乳動物為模型進行，腎臟功能的檢測手段主要有血、尿生化指標測定，以及腎臟組織病理學觀察，這些動物體格較大，飼養和實驗成本高，所需周期長，很難實現化合物毒性的高通量檢測。利用培養細胞系進行體外毒性分析是早期毒性評價的重要替代方法，可快速產生大量的初步結果，由于體外細胞脫離了腎臟所處的復雜的機體內環境，不能真實反映體內各器官相互作用下腎臟功能的變化，所獲得的結果需要到活體動物模型上進一步驗證，因此，評價模型的選擇成為實現化合物毒性快速檢測的瓶頸。

斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚，屬鯉科。其成魚僅約3-4厘米長，產卵量大，胚胎透明而且體外發育，非常便于操作和觀察。其胚胎發育周期短，許多研究在胚胎期即可進行。斑馬魚基因組序列與人類基因組高度相似，包括心血管系統、神經系統在內的多個重要組織器官在形態結構、生理功能及病理反應上與人類相仿，使其作為一種理想的脊椎模式生物，在發育生物學、化合物毒性評價和人類疾病模型研究等領域迅速得到廣泛應用。

斑馬魚胚胎受精后14h(14hpf，14hours?post-fertilization)腎臟開始發育，72hpf時腎臟發育完成。最早在48hpf可以觀察到腎小球濾過現象。斑馬魚腎臟分為幼魚期的前腎和成魚期的中腎，前腎由一對腎單位組成，腎小球在背主動脈腹側的胚胎正中線處融合，腎小管分居兩側。前腎的解剖結構比成魚的中腎及哺乳動物的后腎簡單，但在細胞組成及分子水平上與哺乳動物的腎臟相似，并已具備同樣復雜的生物功能。斑馬魚發育第一周內，由于鰓還未發育完全，主要依賴腎臟排出體內多余的水分和代謝廢物，加之此階段仔魚不必喂食即可存活，干擾因素少，非常有利于開展腎臟毒性相關的研究。斑馬魚胚胎作為整體動物模型，能夠真實反映腎臟在心血管系統、免疫細胞等內環境作用下的病理變化，具備了活體動物實驗結果可靠性高的優點。

目前，在利用斑馬魚胚胎進行化合物腎臟毒性研究中，對腎臟損傷的檢測主要包括表型改變、腎臟病理和腎小球濾過率估測等幾方面。其中，腎小球濾過率是直接反映腎臟功能狀態的重要量化指標，在斑馬魚胚胎是通過計算體內菊粉等類似物質的清除速率測得，需要將顯色標記的菊粉經胚胎心靜脈竇注入循環血液內，由于胚胎較小，此方法對儀器和技術要求比較高，操作難度大。疾病導致機體病理生理發生變化，必然引起組織中代謝組分含量的變化，對這些組分，尤其是一些與器官功能狀態密切相關的生物標志物含量的檢測，是診斷疾病發生、發展的重要依據。肌酐是肌肉的代謝產物，由前體化合物磷酸肌酸轉化而成，主要由腎臟排出體外。腎功能受損時，肌酐在體內蓄積成為有害毒素。在臨床上，檢測血、尿肌酐值是了解腎臟功能的重要指標。斑馬魚胚胎體積小，難以獲取血液或尿液樣本，目前，有關斑馬魚胚胎體內肌酐含量的數據資料及腎功能受損后肌酐水平變化方面的研究尚屬空白。鑒于肌酐在腎功檢測中的重要意義，在利用斑馬魚胚胎進行化合物腎臟毒性研究時，有必要通過一種準確、可靠的方法對此指標進行考察，以進一步補充完善腎臟功能評價體系。

本發明利用液相色譜串聯質譜的方法，對斑馬魚胚胎組織中的肌酐含量進行測定，并與正常斑馬魚胚胎組織的肌酐含量值比較，用于快速、可靠的檢測化合物的腎臟毒性作用。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法。