[發明專利]一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法有效
| 申請號： | 201410334259.X | 申請日： | 2014-07-14 |
| 公開（公告）號： | CN104122355B | 公開（公告）日： | 2017-01-18 |
| 發明（設計）人： | 王雪;劉可春;韓利文;陳錫強;何秋霞;彭維兵;王希敏;侯海榮;張云;孫晨;楚杰 | 申請（專利權）人： | 山東省科學院生物研究所 |
| 主分類號： | G01N30/88 | 分類號： | G01N30/88 |
| 代理公司： | 濟南金迪知識產權代理有限公司37219 | 代理人： | 朱家富 |
| 地址： | 250014 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 通過 檢測 斑馬 組織 含量 評價 化合物 腎臟 毒性 方法 | ||
1.一種通過測定組織中肌酐的含量變化檢測化合物腎臟毒性的方法，其特征在于，步驟如下：
(1)將發育3～6天的斑馬魚胚胎移入含有待測化合物的培養水中，在28℃，14h光照/10h黑暗條件下培養24～72h，做為測試組，去除死亡胚胎，經純水洗凈胚胎表面殘留液后，獲得培育后胚胎，所述培育后胚胎距受精時間不超過7天；
在相同條件下用培養水培養作為正常胚胎組；
(2)向培育后胚胎加入內標溶液，經勻漿、分層提取其中的極性組分，提取樣品經氮吹干后，加入純水溶解，然后過0.45μm聚醚砜水相濾膜，將濾液注入LC-MS/MS，進行分離分析；然后分別將肌酐標準品溶液及內標標準品溶液注入LC-MS/MS，在相同條件下進行檢測；
(3)根據如下公式：
C待測樣品＝C標準品×AA待測樣品/AA標準品
式中：C為提取樣品濃度，AA為色譜峰面積；
計算待測樣品中的肌酐及內標含量，再根據內標提取率計算各組胚胎樣品中的肌酐含量；
(4)胚胎組織中肌酐含量以均值±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗法分析比較組間差異的顯著性，當測試組胚胎組織中肌酐含量高于正常胚胎組胚胎組織中的肌酐含量(P<0.05)，并超過相應發育齡胚胎組織肌酐含量的正常界值范圍，說明胚胎腎臟功能受到損害，受試化合物具有腎臟毒性；
上述各發育齡胚胎組織中肌酐含量的正常界值范圍為：
受精后4d斑馬魚組織中的肌酐水平為30.91～49.09ng/50個胚胎；受精后5d斑馬魚組織中的肌酐水平為36.56～56.32ng/50個胚胎；受精后6d斑馬魚組織中的肌酐水平為58.38～82.06ng/50個胚胎；受精后7d斑馬魚組織中的肌酐水平為84.47～124.81ng/50個胚胎。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所用的斑馬魚為野生型或AB系斑馬魚胚胎。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，上述胚胎為受精3天以上，腎臟已完成發育的野生型或AB系斑馬魚胚胎。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，含有待測化合物的培養水為在培養水中加入待測化合物或待測化合物與助溶劑的混合。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，上述培養水組分為：
NaCl5mmol/L，KCl0.17mmol/L，CaCl20.4mmol/L，MgSO40.16mmol/L，去離子水配制。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，培養期間每24h更換3/4體積的含有待測化合物的培養水。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，胚胎樣品中加入的內標物質為西咪替丁標準品溶液。
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