[發明專利]雜色曲菌素適配體以及相關的電化學生物傳感器

有效

• 申請號: 201410334093.1
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104109676B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發明（設計）人: 劉大嶺;蔣海蘭;姚冬生;謝春芳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N27/26;G01N27/327
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司44202
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明屬于檢測技術領域，涉及一種雜色曲菌素(Ver?A)適配體以及檢測Ver?A的適配體電化學生物傳感器。

背景技術

雜色曲菌素(Ver?A，versicolorin?A)即1,6,8-三羥基-2-羥甲基蒽醌，是黃曲霉毒素B1及雜色曲霉素(sterigmytocystin，ST)合成代謝過程中的重要前體物，其結構含有與AFB1和ST相同的毒性基團—雙呋喃環。研究表明對糧食在儲藏過程中的Ver?A進行監測，有利于對尚未檢出或僅低水平檢出黃曲霉毒素污染的糧食起到預警的作用。此外，20世紀80年代，Wong等初步研究了Ver?A的急性毒性和致畸變性，其LD50(小鼠靜脈注射)為20mg/kg，致突變劑量(ames?test)為800ng/皿，因而雜色曲菌素的毒性不容忽視。

隨著國內外對AFB1、ST的危害性重視程度日益加深，很多高靈敏性的分析檢測方法也隨之成熟，但對Ver?A的污染和檢測關注仍然不足。目前主要的分析檢測的Ver?A方法包括HPLC(高效液相色譜)和TLC(薄層色譜)。HPLC方法分辨率高、穩定性好、成本較低，但是樣品的預處理過程較繁瑣，操作技術水平要求高，對樣品的前處理要求苛刻，靈敏度不夠高；而TLC方法操作簡單、無需復雜儀器，但其靈敏度不高，可靠性也不強。相比而言，酶生物傳感器具有耗時短，操作簡單，特異性強等優點，但由于酶本身的不穩定性，可能造成假陽性或假陰性結果。適配體電化學生物傳感器是基于適配體的特異性作用，采用電化學的檢測手段實現對目標物的定量分析的裝置。與蛋白質相比，適配體具有更優越的特點：親和力高，特異性強，穩定性好，易于修飾，生產成本低，靶分子范圍廣等。因此，利用適配體電化學生物傳感器檢測目標物，不僅具有耗時短，操作簡單、特異性強、靈敏度高、可在線和易于微型化等優點，還避免了酶本身的影響，因此受到了人們高度重視。目前，利用適配體電化學生物傳感器檢測Ver?A尚未見報道。

發明內容

為了解決現有Ver?A檢測技術單一，檢測方案復雜，檢測時間過長的缺點，本發明的第一個目的在于提供一種雜色曲菌素適配體，對于雜色曲菌素(Ver?A)具有高靈敏度、高選擇性，可用于制備檢測Ver?A的核酸適配體電化學傳感器。

本發明所述的雜色曲菌素適配體為含有核心序列AAGCCGCAC的13～21個堿基的單鏈DNA探針，即XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸堿基，n和m表示整數。

根據本發明所述的雜色曲菌素適配體的進一步特征，所述適配體的5’端進行氨基修飾。優選地，所述5’端氨基修飾基團為-(CH₂)₆-NH₂-。

適配體5’端修飾的目的是為了引入固定端，本領域所熟知，不同的支撐基質直接固定適配體所采用的修飾方式是不同的，金電極多采用巰基修飾或生物素修飾，玻碳電極常采用5’氨基修飾，目前公開文獻未見有在金電極上采用5’氨基修飾的方式進行適配體固定。本發明所述的適配體是采用5’端氨基的修飾方式，經實驗表明，既可用于玻碳電極，也可用于目前公開文獻未有報道的金電極。而且，本發明進一步確定了采用-(CH₂)₆-NH₂-的氨基基團修飾的最佳方案。

本發明的第二個目的在于提供一種檢測雜色曲菌素適配體的核酸適配體電化學傳感器，能實現對Ver?A的高靈敏度、高選擇性的快速檢測。

本發明所述的檢測雜色曲菌素適配體的核酸適配體電化學傳感器，包括根據本發明所述的雜色曲菌素適配體。

本發明進一步提供了所述的核酸適配體電化學傳感器的制備方法。

本發明所述的核酸適配體電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

i)金電極預處理：將金電極用氧化鋁粉末水溶液打磨拋光處理后，用超純水及無水乙醇超聲清洗，去除電極表面的氧化鋁粉末，將清洗好的金電極浸入新鮮配制的熱的Piranha溶液(濃硫酸:30％H₂O₂＝7:3，V:V)中活化10min，即得到活化的金電極；

ii)電極修飾：將活化后的金電極浸入到1umol·1^-1適配體組裝液中(含1mol·1^-1NaCl)，4℃下密封組裝22h，得到所述的適配體電化學生物傳感器。

本發明的第三個目的是提供了根據本發明所述的核酸適配體電化學生物傳感器在檢測Ver?A方面的應用。