[發(fā)明專利]雜色曲菌素適配體以及相關的電化學生物傳感器

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410334093.1
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104109676B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發(fā)明（設計）人: 劉大嶺;蔣海蘭;姚冬生;謝春芳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N27/26;G01N27/327
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司44202
• 代理人: 劉宇峰

1.一種雜色曲菌素適配體，其特征在于，所述適配體為含有核心序列AAGCCGCAC的13～21個堿基的單鏈DNA探針，即XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸堿基，n和m表示整數(shù)。

2.根據(jù)權利要求1所述的雜色曲菌素適配體，其特征在于：所述適配體的5’端進行氨基修飾。

3.根據(jù)權利要求1所述的雜色曲菌素適配體，其特征在于：所述5’端氨基修飾基團為-(CH₂)₆-NH₂-。

4.一種檢測雜色曲菌素適配體的核酸適配體電化學傳感器，其特征在于，所述的核酸適配體電化學傳感器包括根據(jù)權利要求要求1至3之一所述的雜色曲菌素適配體。

5.根據(jù)權利要求4所述的核酸適配體電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

i)金電極預處理：將金電極用氧化鋁粉末水溶液打磨拋光處理后，用超純水及無水乙醇超聲清洗，去除電極表面的氧化鋁粉末，將清洗好的金電極浸入新鮮配制的熱的Piranha溶液(濃硫酸:30％H₂O₂＝7:3，V:V)中活化10min，即得到活化的金電極；

ii)電極修飾：將活化后的金電極浸入到1umol·1^-1適配體組裝液中(含1mol·1^-1NaCl)，4℃下密封組裝22h，得到所述的適配體電化學生物傳感器。

6.根據(jù)權利要求4所述的核酸適配體電化學生物傳感器在檢測Ver?A方面的應用。

7.一種基于權利要求4所述的適配體傳感器檢測Ver?A的方法，其特征在于，包括以下步驟：

i)適配體傳感器對Ver?A標準品的檢測及其標準曲線的繪制：

將所述的適配體電化學生物傳感器用ddH₂O沖洗，去除未結合的適配體，將所述適配體電化學生物傳感器作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極作為參比電極，在5m?mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]，含0.1mol·1^-1KCl的電解液中進行微分脈沖伏安分析，記錄適配體傳感器的DPV圖及其峰電流值Ip₀。電化學參數(shù)：工作電位300mV-700mV，掃速為20mV/s，振幅為50mV，靜息時間為2s；

將所述適配體電化學生物傳感器依次置于濃度為：0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的Ver?A標準溶液中，室溫下反應15min，反應后用ddH₂O沖洗去除非特異性吸附的Ver?A。在5m?mol·1^-1的K₃[Fe(CN)₆]，含0.1mol·1^-1KCl的電解液中進行微分脈沖伏安(DPV)分析。電化學參數(shù)：工作電位300mV-700mV，掃速為20mV/s，振幅為50mV，靜息時間為2s；

記錄各個Ver?A濃度下對應的DPV圖譜及其峰電流值Ipn(n＝1,2…9)，計算各標準品相對初始的適配體傳感器的峰電流變化值△Ip。以各Ver?A標準液濃度的對數(shù)為橫坐標，以其對應的△Ip為縱坐標作圖，建立標準曲線；

ii)實際樣品檢測：

玉米樣品處理：取0.1g優(yōu)質玉米粉，加入含4ml80％的甲醇溶液的EP管中，然后分別加入不同濃度的Ver?A標準品，振蕩萃取45min，以5000r/min轉速離心15min，上清用ddH₂O稀釋100倍后用于電化學檢測；

微分脈沖伏安法檢測：根據(jù)權利要求5標準曲線繪制檢測參數(shù)及檢測方法，對分別含0.03ng/ml，0.3ng/ml，0.8ng/ml，50ng/ml的Ver?A玉米樣品進行DPV分析，通過建立的標準曲線，計算出對應的Ver?A的濃度即為實際玉米樣品中Ver?A的濃度。