[發明專利]生物工程菌株及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201410333642.3
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104263748A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 許煜泉;劉海明;周泉;周萬平
• 申請（專利權）人: 武漢漢申生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N1/21;C12N15/01;C12N1/20;C12P17/12;C12R1/38
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明屬于微生物源農藥生產技術領域，尤其涉及一種改進的用于生產新型微生物源殺菌劑的工程菌株的制備及其應用。具體地，本發明涉及制備生物工程菌株的方法、生物工程菌株在制備吩嗪-1羧酸中的用途以及制備吩嗪-1-甲酰胺的方法。

背景技術

假單胞菌生物合成的吩嗪-1-羧酸，是一種重要的抗真菌物質。吩嗪-1-羧酸化學結構中的1位羧酸基團的解離狀態，與其抗菌活性的強弱密切關系。吩嗪-1-羧酸化學結構中的1位羧酸基團經酰胺化，衍生為吩嗪-1-甲酰胺，與吩嗪-1-羧酸相比，其抗菌活性不受使用條件的酸度值影響，從而能穩定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。同時，吩嗪-1-甲酰胺與吩嗪-1-羧酸相比，對小鼠的急性經口毒性下降一個數量級，是一種更為安全的生物殺菌劑。長期以來，由于假單胞菌合成吩嗪-1-甲酰胺的效率較低，生產成本太高，難以實現工業化生產。前不久，我們利用生產吩嗪-1-羧酸的假單胞菌株M18及其衍生的工程菌株M18G為宿主，攜帶能表達phzH基因、編碼產生谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺轉移酶(glutamine?phenazine-1-carboxylic?acid?amidotransferase，PhzH)的重組表達質粒pBBRphzH，在宿主中補充并添加phzH基因的拷貝數，并在宿主中進行表達，將吩嗪-1-羧酸轉化為吩嗪-1-酰胺(具體可參見專利申請：CN201110054035.X；PCT/CN2011/082531)。但是，該技術所使用的出發菌株為生產吩嗪-1-羧酸的野生型菌株M18及其衍生的工程菌株M18G。在野生型菌株M18中，發酵生產吩嗪-1-羧酸的產量僅為每升200毫克左右；在M18衍生的工程菌株M18G中，其發酵效價也只能達到每升1500～1700毫克。由于，在野生型菌株M18和衍生菌株M18G中，作為吩嗪-1-甲酰胺前體的吩嗪-1-羧酸產量相對地都比較低，在優化的培養基中，吩嗪-1-甲酰胺的發酵效價只能達到每升2500～2800毫克，生產成本仍然比較高，難以在農業生產中大規模推廣應。

因而，目前的生產吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株仍有待改進。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中存在的缺陷，提供一種改進的用于高效生產微生物源殺菌劑吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株及其制備方法和應用。

因而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種制備生物工程菌株的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：

1)以假單胞菌株M18G基因組DNA為模板，分別利用第一引物和第二引物進行第一PCR擴增獲得第一擴增產物，利用第三引物和第四引物進行第二PCR擴增獲得第二擴增產物，其中，所述第一擴增產物具有SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸序列，所述第二擴增產物具有SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸序列；

2)利用重疊基因擴增技術，將所述第一擴增產物和所述第二擴增產物進行連接處理，以便獲得連接產物，所述連接產物具有SEQ?ID?NO：8所示的核苷酸序列；

3)將所述連接產物經EcoRI和PstI酶切后，插入質粒pK18mobsacB中，形成重組質粒pK18DU1；

4)將所述重組質粒導入E.coli?S17-1，以便獲得重組大腸桿菌菌株；

5)將所述重組大腸桿菌菌株與所述假單胞菌株M18G進行雙親雜交交換，以便獲得假單胞菌株M18GU；

6)將攜帶phzH基因的重組表達質粒pBBRphzH轉入所述假單胞菌株M18GU，以便獲得攜帶phzH基因的重組表達質粒的生物工程菌株M18GU/pBBRphzH。

需要說明的是，本發明的制備生物工程菌株的方法，通過定向缺失M18衍生菌株M18G的基因組中吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phz1)上游的5’-非編碼區，構建成基因突變菌株M18GU，去除對吩嗪-1-羧酸合成基因簇phz1表達的抑制作用，從而M18GU菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率大大提高；然后將phzH基因重組表達質粒轉化入M18GU菌株，以便獲得能夠高效生產吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株，實現phzH基因的高效表達，并將吩嗪-1-羧酸轉化為吩嗪-1-甲酰胺，從而能夠高效地生產吩嗪-1-甲酰胺。發明人發現，本發明的制備生物工程菌株的方法，操作簡單、適于大規模生產，并且制備獲得的生物工程菌株能夠有效用于吩嗪-1-甲酰胺的生產，且生產效率高，發酵效價穩定，不需要異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導，生產成本低，適宜于大規模生產。