[發明專利]生物工程菌株及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201410333642.3
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104263748A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 許煜泉;劉海明;周泉;周萬平
• 申請（專利權）人: 武漢漢申生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N1/21;C12N15/01;C12N1/20;C12P17/12;C12R1/38
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種制備生物工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以假單胞菌株M18G基因組DNA為模板，分別利用第一引物和第二引物進行第一PCR擴增獲得第一擴增產物，利用第三引物和第四引物進行第二PCR擴增獲得第二擴增產物，其中，所述第一擴增產物具有SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸序列，所述第二擴增產物具有SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸序列；

2)利用重疊基因擴增技術，將所述第一擴增產物和所述第二擴增產物進行連接處理，以便獲得連接產物，所述連接產物具有SEQ?ID?NO：8所示的核苷酸序列；

3)將所述連接產物經EcoRI和PstI酶切后，插入質粒pK18mobsacB中，形成重組質粒pK18DU1；

4)將所述重組質粒導入E.coli?S17-1，以便獲得重組大腸桿菌菌株；

5)將所述重組大腸桿菌菌株與所述假單胞菌株M18G進行雙親雜交交換，以便獲得假單胞菌株M18GU；

6)將攜帶phzH基因的重組表達質粒pBBRphzH轉入所述假單胞菌株M18GU，以便獲得攜帶phzH基因的重組表達質粒的生物工程菌株M18GU/pBBRphzH。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物分別具有SEQ?ID?NO：2-3所示的核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分別具有SEQ?ID?NO：4-5所示核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，將所述第一擴增產物和所述第二擴增產物進行連接處理，進一步包括：

將所述第一擴增產物和所述第二擴增產物混合，并利用DNA聚合酶LA?Taq進行第三PCR擴增，以便獲得第三擴增產物；

利用第一引物和第四引物進行第四PCR擴增，以便獲得第四擴增產物；

將所述第四擴增產物進行純化回收，以便獲得所述連接產物。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述第三PCR擴增的反應程序為：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，10個循環；72℃1min，

所述第四PCR擴增的反應程序為：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，25個循環；72℃1min。

5.一種生物工程菌株，其是由權利要求1-4任一項所述的方法制備獲得的。

6.權利要求5所述的生物工程菌株在制備吩嗪-1-甲酰胺中的用途。

7.一種制備吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將權利要求5所述的生物工程菌株進行活化，其中，所述生物工程菌株是通過權利要求1-4任一項所述的方法制備獲得的；以及

將活化的生物工程菌株進行種子擴大培養，以便獲得吩嗪-1-甲酰胺。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化進一步包括：

將所述生物工程菌株接種于甘油培養基平板，在26-30℃下，活化生長20-24小時；以及

在所述甘油培養基平板上劃菌塊，于26-30℃下活化10-12小時，

其中，所述甘油培養基中各組分的重量百分比為：蛋白胨1.8-2.2％，甘油1.3-1.7％、硫酸鎂0.05-0.10％、磷酸二氫鉀0.01-0.05％、瓊脂1.2-1.5％、余量為水，pH6.8-7.2。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述種子擴大培養進一步包括：

將所述活化的生物工程菌株，轉接到含有25毫升甘油培養液、體積為250毫升的三角瓶中，在26-28℃的搖床中振蕩培養11小時，搖床轉速為160-180轉/分；以及

然后，轉接到含有65毫升的產素培養液、體積為500毫升的三角瓶中，進行放大發酵培養，溫度和轉速不變，發酵時間為72小時，

其中，所述甘油培養液中各組分的重量百分比為：蛋白胨1.8-2.2％、甘油1.3-1.7％、硫酸鎂0.05-0.10％、磷酸二氫鉀0.01-0.05％、余量為水，pH6.8-7.2，

所述產素培養液中各組分的重量百分比為：黃豆粉6.5-8.0％、玉米漿1.0-2.0％、甘油1.0-2.0％、葡萄糖0.5-1.5％、硝酸鉀0.8-1.8％、余量為水，pH7.5-8.0。