[發明專利]無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器的制備和應用

有效

• 申請號: 201410332908.2
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104155445A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 張勇;李建修;魏琴;馬洪敏;杜斌
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于，制備步驟為：

（1）金?@?銀核殼納米棒?–?魯米諾?–?殼聚糖復合材料（Au@AgNRs-Lum-Chi）的制備

將20mL金納米棒溶膠（AuNRs）和20mL?0.05~0.2?mol/L的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液混合，在30~45℃下攪拌，并順序加入3~6?mL?0.1?mol/L的?L-抗壞血酸（AA）溶液、0.5~1?mL?0.05?mol/L的硝酸銀（AgNO₃）溶液和?3~6?mL?0.1?mol/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液，停止攪拌，靜置1~3h，離心分離，將產品重新分散到20mL?水中，得到金?@?銀核殼納米棒溶膠（Au@AgNRs）；

將3~5?mL的Au@AgNRs和?3~5?mL?1×10^-3?mol/L的魯米諾（Lum）溶液混合，攪拌1~3h，離心分離，將產品重新分散到5mL質量分數為0.3?~?0.7?%的殼聚糖（CHi）溶液中，得到Au@AgNRs-Lum-Chi溶液；

所述的AuNRs是20~40nm長的棒狀金納米粒子的水溶液；

所述的Chi溶液是將Chi純品加入到體積分數為1%?的醋酸中制備而成；

（2）磷酸鈷銨片狀材料（NH₄CoPO₄）的制備

在40mL水中加入2.0~4.0?g銨鹽和0.15~0.25?g磷酸鹽，完全溶解后，加入0.15~0.25?g氯化鈷，在30~45℃下攪拌10~14h，離心分離，將產品置于50℃下干燥，即得到NH₄CoPO₄；

所述的銨鹽選自下列之一：氯化銨、溴化銨、磷酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨；

所述的磷酸鹽選自下列之一：磷酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨；

（3）無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器的制備方法

1）對工作電極進行預處理：將直徑4?mm的玻碳電極依次用1.0、3.0和0.05?μm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，依次用乙醇和超純水進行超聲清洗；

2）在1）中得到的電極表面滴加5~10?μL?1~5?mg/mL的NH₄CoPO₄水溶液，室溫下自然晾干；?

3）在2）中得到的電極表面滴加5~10?μL的Au@AgNRs-Lum-Chi溶液，4?℃?冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4?℃保存；

4）在3）中得到的電極表面滴加5~8?μL?10?μg/mL的腫瘤標志物抗體溶液，4?℃?冰箱中保存晾干；

5）在4）中得到的電極表面滴加4~6?μL?100?μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，4?℃?冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4?℃保存，制得無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器。

2.如權利要求1所述的無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器，用于腫瘤標志物的檢測，步驟如下：

1）將已知濃度的腫瘤標志物抗原標準溶液加入到40~60?μL、pH=7.0~8.0的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10?μL抗原混合溶液滴涂到所制備的無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器的工作電極上，在4?℃?冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4?℃保存；

2）以飽和甘汞電極作為參比電極、鉑絲電極作為對電極，與1）中組裝的工作電極組成三電極系統，連接到電致化學發光設備上；在電解槽中先后加入10~25mL?pH=7.0~8.0的PBS緩沖溶液和1mL?3~6?mmol/L的過氧化氫（H₂O₂）溶液；用循環伏安法對組裝的工作電極施加循環電壓；根據所得的電致化學發光的光信號強度與腫瘤標志物抗原標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；

3）將待測樣品溶液代替腫瘤標志物抗原的標準溶液，按照所述腫瘤標志物抗原的工作曲線的繪制方法進行檢測。

3.如權利要求1和2所述的無標記電化學發光腫瘤標志物免疫傳感器的制備和應用，其特征在于所述腫瘤標志物選自下列之一：癌胚抗原（CEA）、前列腺特異性抗原（PSA）、CA-125、CA-199、CA-242、CA-724、甲胎蛋白（AFP）、鱗狀細胞癌抗原（SCC）。