[發明專利]一種高靈敏度測試游離生物素的方法

無效

• 申請號: 201410331877.9
• 申請日: 2014-07-14
• 公開（公告）號: CN104330288A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 胡國華;嚴婷
• 申請（專利權）人: 普研（上海）標準技術服務有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N21/31
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 肖愛華

技術領域

本發明屬于微生物食品檢測領域，具體地，涉及一種高靈敏度測試游離生物素的方法，特別是針對嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的檢測。

技術背景

生物素又稱為維生素H,是水溶性維生素，屬于B族維生素，是含硫的一種維生素，也是生物體內羧基轉化酶作用的一種輔酶，故又稱為輔酶R。

生物素是生物題生長發育必需的一種營養素，它參與有機體多種主要的新陳代謝活動。特別是對嬰幼兒及孕產婦有著特殊的重要性,因此在嬰幼兒乳制品、孕產婦乳制品及食品營養強化劑中添加生物素是十分必要的。其主要的性能與用途有：構成視沉細胞內感光物質；維持上皮組織結構的完整和健全；增強機體免疫反應和抵抗力和維持正常生長發育。

生物素主要來源于牛奶、牛肝、蛋黃、動物腎臟、草莓、柚子、葡萄等水果中，此外，瘦肉、糙米、啤酒、小麥中也含有生物素。

近些年生物素的發展越來越受到關注，檢測的方法也比較多，但每種檢測方法的原理，時效，以及針對的產品都各不相同，故在實際應用上，能針對樣品的不同而選擇合適的生物素檢測方法也是至關重要的。

常用的生物素檢測方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色譜法、酶聯免疫法、熒光法等。

其中微生物的方法是目前應用比較廣泛的方法，也是嬰幼兒食品和乳品中游離生物素國標檢測方法中唯一的檢測方法，這個方法主要用于檢測樣品中生物素含量較少的情況，原理是利用生物素營養缺陷型菌株對生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試驗中待測物質的含量。在含有除待測物質以外的所有營養成分的培養基中，微生物的生長與待測物質含量呈線性關系，根據透光率與標準工作曲線進行比較，即可計算出試樣中待測物質的含量。

選用上述傳統的檢測方式，此方法雖然靈敏度高，但該方法工作量大，在用分光光度計讀數時要求漩渦混合后立即移入比色皿內進行讀數，并且要求每支試管的穩定時間相同，對操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測1到3個培養管，檢測效率低，也會增加誤差，費時費力，因此需要開發一種更簡便和實用的檢測方法。

發明內容

本發明旨在克服現有技術中的不足之處，提供一種簡便、高效的游離生物素的檢測方法。

本發明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿菌對游離生物素的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成正比的關系，根據吸光值與工作曲線進行比較，即可算出試樣中待測物的濃度；其中，吸光值為采用酶標儀測量培養后的液體獲得的吸光度。

其中，本發明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其植物乳桿菌為ATCC8014。

另外，本發明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，還具備這樣的特點，即、具體分析步驟如下所示：步驟一、接種菌懸液的制備；步驟二、樣品的處理；步驟三、標準曲線的制作；步驟四、待測液的制作；步驟五、滅菌；步驟六、接種；步驟七、培養；步驟八、分析測試；其中，在步驟七中將試管放入培養箱內，36℃±1℃培養19h～20h。

此外，在上述步驟八中具體地，包括如下測試程序:

(1)、對每支試管進行視覺檢查，接種空白試管S1內培養液應是澄清的，若出現渾濁，則結果無效；

(2)、以接種空白孔S1做對照，測定最高濃度標準曲線試管的吸光度，兩小時后重新測定，兩次結果透光率差值若小于2％，則取出全部檢驗管測其吸光度A；

(3)、以接種空白試管S2為空白，調節吸光度為0，一次讀出其他每支試管的吸光度A，樣品空白的吸光度A一并讀出；

(4)、充分混合每一支試管后，立即將培養液移入96孔板中，每孔200uL,每個試管讀數前搖勻樣液，于660nm波長下讀吸光值；

上述混合過程，優選用漩渦混合器充分混合每一支試管，之后還可根據需要加入一滴消泡劑。

(5)、對每個編號的待測液孔，用每個孔的吸光度值計算每毫升該編號待測液生物素的含量，并計算該編號待測液的生物素含量平均值。每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的±15％，超過者要舍去，如果符合該要求的孔少于所有四個編號待測液總孔數的2/3，需要重新檢驗；如果符合該要求的孔數大于等于原來孔數的2/3，重新計算每一編號的有效試樣孔中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣孔的總平均值，用于計算試樣中的生物素含量。

上述方法主要應用于測定嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素。

本發明的作用和效果