[發明專利]一種用于檢測ALK融合基因的熒光定量PCR方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201410331553.5
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104073563A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 周細武;黃清;邱英華
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種采用熒光定量PCR檢測融合基因的方法，特別涉及一種用于檢測間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic?Lymphoma?Kinase，ALK)融合基因的熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，可在突變含量只有0.1％的臨床樣本中檢測出低至10個拷貝的融合基因突變分子。

背景技術

肺癌是世界范圍內發病率和死亡率均最高的惡性腫瘤。分子靶向藥物作為治療肺癌的新的有效手段，在臨床得到越來越廣泛的應用。特異性抑制間變性淋巴瘤激酶(ALK)的靶向藥物克唑替尼(crizotinib)對由于ALK基因融合而導致ALK激酶活性過高的非小細胞肺癌病人具有很好的療效，已于2011年獲美國食品與藥品監管局(FDA)批準上市。此外，數個類似的針對ALK的靶向藥物亦已進入臨床研究。克唑替尼等靶向藥物的使用前提是病人的腫瘤細胞必須高表達ALK激酶；而ALK基因融合是導致ALK激酶高表達的最主要原因。因此，準確地檢測腫瘤組織中ALK基因融合對臨床篩選出可受益于克唑替尼等靶向藥物的肺癌患者具有指導作用。目前臨床主要開展的ALK基因融合的方法包括熒光原位雜交和免疫組織化學方法。這兩種方法存在操作復雜、主觀性強、耗時長、費用高等缺點，因而難以在臨床普遍使用。臨床上迫切需要一種簡便、快速、準確、經濟的ALK基因融合檢測方法，用以指導肺癌的個性化治療。

ALK基因與其他基因發生融合突變可導致ALK激酶片段大量表達并自發性激活[1]。其中，EML4-ALK融合基因為迄今所發現的在非小細胞肺癌中發生率最高的ALK融合類型。EML4-ALK基因融合是由于人類第二號染色體短臂發生倒置(inversion)，導致棘皮動物微管相關蛋白樣4基因(EML4)與ALK非正常連接所致[2]。此外，研究還發現ALK可與KIF5B、NPM等基因發生融合[4，5]。這些融合基因的蛋白質產物由于融合伴侶(如EML4，NPM等)的特性而形成二聚體，進而引發ALK激酶片段的不依賴于配體的自發性激活。活化的ALK激酶通過激活下游的細胞生長調控相關信號通路如P13K/AKT和MAPK等，促進細胞生長和增殖，抑制細胞凋亡，從而引起細胞的瘤變[2]。動物實驗已經證實EML4-ALK基因融合突變可導致小鼠肺癌的發生[3]。

準確、方便地檢測肺癌細胞中的ALK融合情況是明確篩選適合于克唑替尼等靶向藥物治療的病人的基礎。但是，目前對于ALK融合基因的檢測方法尚缺乏一個明確的標準。熒光原位雜交方法(fluorescent?in?situ?hybridization，FISH)是基礎和臨床研究中檢測基因融合的常用方法。FISH的原理是基于兩種不同熒光標記的探針(綠色和紅色)分別結合在ALK基因5’端兩個相鄰的區域，在正常細胞中這兩種熒光緊密相連；當ALK基因發生斷裂時，這兩種熒光產生分離[6]。FISH方法具有直觀的優點，但存在熒光探針不穩定、技術要求高、操作復雜、耗時長、費用高等缺點。臨床上使用的另外一種檢測方法是免疫組織化學方法。免疫組化方法檢測的是ALK蛋白質分子的表達水平。其最大的優點是能在檢測ALK的蛋白表達水平的同時，觀察腫瘤組織的細胞形態和病理特征[7]。但是，由于ALK在肺癌細胞中的表達水平往往較低，免疫組化方法會造成假陰性結果；此外，免疫組化往往難以對ALK的水平進行準確的定量，結果判讀較主觀，而且耗時較長、抗體不穩定[7]。

最近，Soda等用多重RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌組織的EML4-ALK和KIF5B-ALK基因融合，發現該方法與FISH和改良免疫組化方法具有相同的靈敏度和特異性，但卻更為方便[4]。RT-PCR方法是先將RNA逆轉錄成cDNA，再利用分別來自融合基因兩個部分的特定DNA序列作為引物對cDNA進行擴增，然后對PCR產物進行測序。但是，該技術存在明顯的缺陷：(1)只能檢測出已知的突變，不能用于檢測新的融合突變，因此會導致假陰性；(2)同時檢測多種融合類型需要標本量人，技術復雜；(3)擴增后的后續測序步驟易發生擴增物的擴散而污染操作環境，導致假陽性。

由于針對ALK激酶的靶向藥物如克唑替尼等所作用的是因過度表達而導致過高活性的ALK激酶，而不是基因的融合形式，本發明采用一種全新的設計，著眼于對ALK激酶的表達水平變化的檢測，而不受限于ALK融合突變的形式和種類。該方法將有效地檢測因融合所導致的ALK基因的表達水平的增高，將避免FISH、免疫組化或RT-PCR方法的缺點。

發明內容