[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)ALK融合基因的熒光定量PCR方法及檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410331553.5
• 申請(qǐng)日: 2014-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104073563A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周細(xì)武;黃清;邱英華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種檢測(cè)ALK基因融合突變的方法，該方法的特征在于：不受限于融合基因類型而可直接檢測(cè)ALK融合狀態(tài)及表達(dá)水平。

2.如權(quán)利要求1所述，人類ALK基因(NM_004304)第20號(hào)至29號(hào)外顯子包含蛋白激酶區(qū)域，本發(fā)明針對(duì)對(duì)臨床具有最根本意義的蛋白激酶區(qū)域，在第20號(hào)-29號(hào)外顯子上選擇數(shù)個(gè)特定序列，設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)的特異性引物和熒光標(biāo)記分子探針，檢測(cè)ALK基因的總體表達(dá)水平(非融合表達(dá)+融合表達(dá)，T)；同時(shí)，在第1號(hào)-19號(hào)外顯子上選擇數(shù)個(gè)特定序列，設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)的特異性引物和熒光標(biāo)記分子探針，檢測(cè)ALK基因的基本表達(dá)水平(非融合表達(dá)，B)；如果T值與B值的比例(T/B?ratio)等于或大于2，則表明ALK基因存在因融合突變導(dǎo)致的激酶區(qū)域過(guò)表達(dá)；如果T值與B值的比例(T/B?ratio)小于2，則表明ALK基因不存在因融合突變導(dǎo)致的激酶區(qū)域過(guò)表達(dá)。

3.如權(quán)利要求1所述，在激酶區(qū)以第20號(hào)至29號(hào)外顯子為模板設(shè)計(jì)的引物和探針，特別是以20～26號(hào)外顯子為模板設(shè)計(jì)的引物和探針，其中最適宜的模板區(qū)域?yàn)?0～23號(hào)外顯子；在非激酶區(qū)以第1號(hào)至19號(hào)外顯子為模板設(shè)計(jì)的引物和探針，特別是以11～19號(hào)外顯子為模板設(shè)計(jì)的引物和探針，其中最適宜的模板區(qū)域?yàn)?1～14號(hào)外顯子。

4.用于檢測(cè)ALK基因融合突變的特異性引物和探針，包括8組24條引物和探針，見(jiàn)本發(fā)明說(shuō)明書(shū)表1(A-SEQ-1～A-SEQ-24)。

5.一種檢測(cè)ALK基因融合突變的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1、2所述的方法和權(quán)利要求4所述的8組24條引物和探針。

6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)ALK基因融合的檢測(cè)試劑盒，包括以下熒光定量PCR反應(yīng)體系：

7.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)ALK基因融合突變的檢測(cè)試劑盒，熒光定量PCR反應(yīng)條件為：

95℃預(yù)變性10min后進(jìn)入以下循環(huán)：95℃15sec，61℃1min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集溫度設(shè)定在61℃退火溫度處。

8.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)ALK基因融合突變的檢測(cè)試劑盒，待檢測(cè)樣品包括新鮮病理組織、石蠟包埋病理組織、石蠟切片和血液。

9.一種用于檢測(cè)ALK基因融合突變的引物和探針，其特征在于，由A-SEQ-1～A-SEQ-24的寡核苷酸引物和探針或序列與其有至少70％同一性的寡核苷酸組成。