[發明專利]用真核分泌表達系統制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法

無效

• 申請號: 201410331142.6
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN104059894A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 宋健;魏景艷;邢瑞慶
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/85
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 王恩遠

本發明專利申請是分案申請。原申請的發明名稱為“基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶”，申請日為2013年4月24日，申請號為201310142866.1。

技術領域

本發明是一種應用基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，屬于生物技術領域，涉及基因重組技術、基因突變技術和重組蛋白表達技術。

背景技術

含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)一起構成了機體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解體內的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內活性氧(ROS)，防止脂質過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、白內障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，還能降解脂質過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨特的保護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的來源相當有限、穩定性差，致使它的人工產物及其模擬物的研究備受關注。

小分子模擬物主要有PZ51(ebselen)，AL3823A，BXT系列產品，它們的弱點是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶(中國專利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉移酶(GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽(GSH)結合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX模擬酶收到了更好的效果，因此開發制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術就成了學術界的研究熱點，對于分子生物學，生物工程學及醫學等領域具有廣闊的應用前景。迄今已成功開發的方法有：用化學法(中國專利94102481.4，96112628.0)或缺陷型原核表達系統(中國專利200810050556.6)在非GPX類模板蛋白中引入GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)。

中國專利94102481.4，96112628.0，99104234.4，200810050556.6公開的各類含硒抗體酶的制備方法就是應用化學突變(修飾)法在抗體類模板蛋白中引入GPX的催化基團SeCys，有以下缺點：(1)在制備過程中，僅化學突變(修飾)這一步就會損失20-40％的酶蛋白，導致模擬酶產率顯著下降；(2)制備模擬酶的周期長，操作繁瑣，時間長；(3)在化學突變過程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質為有毒性的物質；(4)缺乏靶向性，對于大的蛋白分子而言，一次化學反應常在不同位點引入多個非特異性催化基團，因此化學突變引入催化基團無法達到基因突變法那樣的專一性。

中國專利200810050556.6也公開了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法是用缺陷型原核表達系統(大腸桿菌)和基因突變法引入催化基團，但其僅限于人源單鏈含硒抗體酶的制備，不包括重組谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及其它GPX模擬酶的制備方法。另有報道：具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的制備方法。這種方法雖然也采用缺陷型原核表達系統和基因突變法引入催化基團，但其僅限于以GST為模板蛋白制備GPX模擬酶，不包括以天然GPX為模板制備重組GPX。用缺陷型原核表達系統在非GPX類模板蛋白中引入催化基團制備模擬酶的方法是將催化基團引入到與GPX有相同底物GSH結合部位的它種蛋白中使其產生GPX活力。然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團，因此很難找到理想而準確的催化基團的位置；同時由于這些模板蛋白中也沒有象天然GPX那樣理想的催化三聯體，因此這類模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工程方法來制備重組GPX則可克服這些缺點。

由于編碼GPX的催化基團SeCys的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原核表達系統中，需在GPX基因的開放閱讀框內、緊鄰SeCys的密碼子UGA下游引入頸環結構才能將UGA翻譯成SeCys而不是終止密碼子，而開放閱讀框內頸環的引入必然會引起GPX空間構象的改變，進而影響酶活性。因此普通原核表達系統不適于直接表達具有GPX活性的含硒蛋白。

發明內容