[發明專利]用真核分泌表達系統制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法

無效

• 申請號: 201410331142.6
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN104059894A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 宋健;魏景艷;邢瑞慶
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/85
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 王恩遠

1.一種用真核分泌表達系統制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，是用哺乳類細胞制備重組GPX，其特征在于，具體過程是，

1)表達載體的構建：

在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX基因序列設計引物擴增或直接合成GPX的編碼基因，確保GPX基因的5′端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3′端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2C端的512個氨基酸(343-854aa)的基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3′端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2)陽性細胞株的篩選：

用含有硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2和GPX基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2和GPX兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；

3)靶蛋白的表達與純化：

在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。

2.根據權利要求1所述的用真核分泌表達系統制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，其特征在于，所述的檢測GPX蛋白的表達量，是用每種靶蛋白的抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。

3.根據權利要求1所述的基因工程法制備重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX，其特征在于，所述的用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/L谷胱甘肽的緩沖液洗脫目的蛋白。

4.一種用真核分泌表達系統制備重組谷胱甘肽過氧化物酶的方法，是分步用含有硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因的載體和含有GPX基因的載體轉染同一哺乳類細胞，具體過程是，

1)表達載體的構建：

在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中GPX的基因序列設計引物擴增或直接合成GPX的編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3′端在終止密碼子下游引入硒代半胱氨酸插入序列和期望的酶切位點；用多克隆位點將GPX基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持氨基酸序列不變的前提下，根據基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2C端的512個氨基酸(343-854aa)的基因序列設計引物擴增或直接合成其編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子和期望的酶切位點，3′端含有終止密碼子和期望的酶切位點，用多克隆位點將硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的多克隆位點，是載體上固有的由多個核酸限制性內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2)陽性細胞株的篩選：

先用含有硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2的細胞株。再用含有GPX基因的載體轉染穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白2和GPX兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；

3)靶蛋白的表達與純化：

在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達重組GPX，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化重組GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。