[發(fā)明專利]重組ULP1激酶的編碼序列、編碼蛋白、含有該編碼序列的質(zhì)粒、及重組ULP1激酶的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410331141.1
• 申請(qǐng)日: 2014-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN104099354A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟爾;張東裔;吳慧;鮑邵衡;李文穎;吳磊;朱凌云;柳瓏;王干
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/54
• 分類號(hào): C12N15/54;C12N15/70;C12N9/12;C12R1/19
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組ULP1激酶的編碼序列、編碼蛋白、含有該編碼序列的質(zhì)粒、及重組ULP1激酶的制備方法。?

背景技術(shù)

多肽或者蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的融合表達(dá)是非常常見的技術(shù)，但是為了將目的多肽或者蛋白從融合蛋白中釋放出來，往往需要使用價(jià)格不菲的蛋白激酶或者利用內(nèi)含肽的自斷裂。內(nèi)含肽的自斷裂對(duì)目的多肽的N端或C端的第一個(gè)氨基酸有偏好性，且斷裂效果不穩(wěn)定，因此目前主要是使用各類蛋白激酶來切割融合蛋白，從而釋放出目的多肽(蛋白質(zhì))。?

目前常見的切割融合蛋白的蛋白激酶有凝血酶，因子10蛋白，腸激酶，TEV激酶，PreScission激酶，TAGZyme激酶，HRV3C激酶，ULP1激酶。不過考慮到切割產(chǎn)物是否會(huì)產(chǎn)生多余氨基酸、切割效率、以及切割位點(diǎn)的特異性這三方面因素，我們發(fā)現(xiàn)只有腸激酶與ULP1激酶符合該條件。腸激酶是識(shí)別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys結(jié)構(gòu)，而ULP1激酶卻是識(shí)別100個(gè)氨基酸的SUMO標(biāo)簽形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此ULP1激酶具有更好的切割特異性。同時(shí)SUMO標(biāo)簽除了作為ULP1激酶的切割識(shí)別位點(diǎn)，也可以做為助溶標(biāo)簽使用，可以減小整個(gè)融合蛋白的長度。綜合以上的結(jié)論，我們認(rèn)為ULP1激酶是目前為止最優(yōu)的蛋白切割酶類，具有最好的切割活性以及切割位點(diǎn)的特異性。通過調(diào)研國內(nèi)相關(guān)專利，我們發(fā)現(xiàn)國內(nèi)還沒有ULP1激酶制備的相關(guān)專利。國外相關(guān)文獻(xiàn)中，雖然有相關(guān)報(bào)道，但是其制備工藝較為復(fù)雜而且純度較低。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組ULP1激酶的編碼序列、編碼蛋白、含有該編碼序列的質(zhì)粒、及重組ULP1激酶的制備方法。?

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：?

所述重組ULP1激酶的編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

所述質(zhì)粒含有SEQ?ID?NO.1所示的編碼序列，優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為pCD-ULP1，其全序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

所述蛋白序列如SEQ?ID?NO.3所示。?

所述重組ULP1激酶的制備方法包括如下步驟：?

(1)根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏好，對(duì)ULP1_(403-621)這部分蛋白所對(duì)應(yīng)的編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成后的編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示；將SEQ?ID?NO.1所示的序列通過酶切方式接入表達(dá)載體pCold-II，得到質(zhì)粒pCD-ULP1；?

通過分析國內(nèi)外文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)來自于釀酒酵母的ULP1激酶一共含有621個(gè)氨基酸，但是只需要保留403-621這一區(qū)域的氨基酸，即可保留該激酶對(duì)SUMO標(biāo)簽的特異性識(shí)別與切割活性，本發(fā)明所涉及的ULP1激酶制備均是指403-621這部分活性區(qū)域的制備；?

(2)將質(zhì)粒pCD-ULP1轉(zhuǎn)入大腸桿菌，37℃倒置培養(yǎng)過夜；?

(3)挑取單菌落至505培養(yǎng)基，于37℃條件下進(jìn)行種子培養(yǎng)7—9h；?

(4)將種子培養(yǎng)基接入5052培養(yǎng)基，接種量為0.08—1.2％，于16—37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16—72h后離心收集菌體；?

(5)將收集的菌體超聲破碎后過鎳柱純化：首先過PBS平衡鎳柱，然后用咪唑洗脫重組的ULP1激酶，再將洗脫出的重組ULP1激酶脫鹽并收集保存。?

優(yōu)選地，步驟(2)所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)，也可以為其他本領(lǐng)域常用的其他菌種。?

步驟(3)種子培養(yǎng)時(shí)的搖床轉(zhuǎn)速為220rpm。?

步驟(4)所述離心條件是4℃、5000rpm、離心30min。?

所述步驟(5)是將收集的菌體用PBS懸浮，然后將懸浮的菌體在功率30％、開5s停12s條件下超聲破碎30min，再將破碎后的菌體于4℃、15000rpm條件下離心30min后過鎳柱純化。所述咪唑洗脫是用50mM咪唑和200mM咪唑各洗脫一次后再用400mM咪唑洗脫；然后將洗脫液加入超濾管中，于4℃、5000rpm條件下離心30min進(jìn)行脫鹽。?

上述505與5052培養(yǎng)基配方參見Protein?Expr?Purif41,207-234.(2005)。?

本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊(cè)等加以實(shí)施。?

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：?