[發明專利]一種用于DNA熒光檢測的復合納米銀薄膜的制備方法

有效

• 申請號: 201410330867.3
• 申請日: 2014-07-11
• 公開（公告）號: CN104089934A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 李立東;王曉瑜;朱茜;唐馥
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C23C18/44
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

技術領域

本發明涉及功能高分子薄膜材料領域，特別涉及一種復合納米銀薄膜的制備方法，具有優異的DNA熒光檢測功能。

背景技術

DNA是基因的重要組成部分，DNA序列的變化會導致遺傳變異或各種疾病的產生。因此，實現對DNA高效、靈敏地檢測對基因突變、單核苷酸多態性、臨床診斷以及基因表達等研究具有重要意義。熒光檢測技術由于具有檢測效率高和檢測靈敏度高等優點，已被廣泛應用于化學和生物傳感等領域。目前的DNA熒光檢測大多為均相溶液檢測體系，利用熒光染料與DNA的特異性結合作用實現對DNA的檢測。但是，該檢測體系容易受溶液中溶劑極性、pH值及平衡離子等環境因素的影響，并且體系的重復利用率低，不易制備成器件，從而使DNA檢測的靈敏度和效率大大降低。

近年來，隨著基因芯片與DNA微陣列技術的發展，基于固體表面的DNA檢測可以實現單次多樣品同時檢測，檢測效率顯著提高。然而，這些分析方法往往需要標記有熒光物質的多肽核酸探針或者DNA探針，提高了檢測成本，限制了其商業推廣。同時，熒光染料在固體表面的光穩定性差，發光效率低，影響DNA檢測的靈敏度。

納米銀具有獨特的表面等離子體，可以與其附近的熒光分子相互作用，增強熒光分子的熒光強度以及穩定性。將納米銀的增強熒光效應與DNA的熒光檢測將結合，在優化檢測靈敏度和提高檢測效率方面，相比合成性能優異的熒光染料，具有操作簡單、省時省力等無法比擬的優勢。因此，發明一種制備簡單實用，具有提高DNA檢測熒光信號的納米銀薄膜是十分必要的。

發明內容

本發明的目的在于克服現有固相DNA檢測體系在檢測DNA時，制備繁瑣，熒光強度低，檢測不靈敏等缺陷，提供一種制備簡單、價格低廉并且易于器件化的用于DNA熒光檢測的復合納米銀薄膜及其制備方法。

本發明的技術方案是采用層層自組裝技術制備含有海藻酸鈉的多層膜，利用海藻酸鈉原位還原制備納米銀基底，隨后吸附殼聚糖、聚丙烯酰胺以及檢測DNA,利用納米銀基底的表面等離子體效應增強DNA嵌入染料的熒光，實現DNA高靈敏檢測。如圖1所示。

本發明的具體步驟如下：

(1)將固體基片浸于雙氧水和濃硫酸體積比為2:5-1:2的混合溶液中，保持0.5-1小時取出后，并用去離子水沖洗干凈氮氣吹干待用。

(2)將上述固體基片浸入1-2mg/mL帶正電的陽離子聚電解質溶液保持15-30分鐘后取出并用去離子水沖洗，氮氣吹干；再將其浸入的1-2mg/mL帶負電的海藻酸鈉溶液保持15-30分鐘后取出并用去離子水沖洗，用氮氣吹干；重復以上過程制備自組裝多層膜。

(3)將步驟(2)制備的自組裝多層膜浸入預先配制的質量百分比為0.5-2％的銀氨溶液中，升溫至60-80℃溫度范圍內，保溫并攪拌0.5-1小時，制得納米銀薄膜。

(4)將步驟(3)制備的納米銀薄膜浸入1-2mg/mL的帶正電的殼聚糖溶液保持15-30分鐘，取出并用去離子水沖洗用氮氣吹干；再將其浸入1-2mg/mL的帶負電的聚丙烯酸溶液保持15-30分鐘取出并用去離子水沖洗用氮氣吹干；重復以上過程得到殼聚糖/聚丙烯酰胺/殼聚糖/聚丙烯酰胺/殼聚糖/聚丙烯酰胺/殼聚糖中間層結構。

(5)將擴增前后的DNA與吖啶類染料分別混合，涂覆于步驟(4)所制備的復合納米銀薄膜表面，保持2-5小時后用去離子水沖洗氮氣吹干。

(6)采用熒光光譜儀測定不同薄膜上吖啶類染料的熒光強度，熒光強度高的為擴增后的DNA,熒光強度低的為未擴增的DNA。

步驟(1)中所述的固體基底優選為石英片、玻璃片、硅片。

步驟(2)中所述的帶正電的陽離子聚電解質優選為聚丙烯基氯化銨，聚乙烯亞胺，聚乙烯胺，聚二甲基二烯丙基氯化銨，聚乙烯吡啶，殼聚糖等中的一種或幾種。

步驟(2)中所述的自組裝多層膜優選為雙層、三層或多層結構。

步驟(4)中所述的殼聚糖溶液，可將50-100mg殼聚糖加入50ml去離子水中，攪拌并升溫至40-50℃溫度范圍內，隨后加入50-100μL醋酸溶液，攪拌12h后過濾。

步驟(5)中所述的待測DNA可為雙鏈結構或單鏈結構。

步驟(5)中所述的吖啶類染料可為吖啶黃、吖啶橙及其衍生物中的一種或幾種。

步驟(5)中所述的DNA與吖啶類染料分別混合后的溶液總體積為80-100μL。