[發明專利]誘導型異源雙鏈產生子的改進

在審

• 申請號: 201410330731.2
• 申請日: 2005-10-10
• 公開（公告）號: CN104293779A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: L·A·蒂利
• 申請（專利權）人: IHG法瑪柯有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

本申請是2005年10月10日提交的題為“誘導型異源雙鏈產生子的改進”的中國專利申請200580034310.4的分案申請。

技術領域

本發明涉及誘導型異源雙鏈產生子(induced?heteroduplex?generator，IHG)分子，其提供了對現有技術中已知的此類分子的改進。本發明進一步涉及用于在本發明改進的IHG和靶基因組DNA序列之間形成誘導型異源雙鏈的方法，以及涉及所述的誘導型異源雙鏈用于對動物(例如哺乳動物)、植物、病毒或細菌的DNA、通常是人DNA中的突變進行基因型分型(genotyping)的分析方法。因此，本發明可被用于，例如，關于與遺傳性疾病相關的基因中的多態性和突變(例如囊性纖維化(CFTR基因)、苯丙酮酸尿癥(PAH基因)、鐮刀形紅細胞病和β-地中海貧血病(HBB基因)，以及致癌基因和腫瘤抑制基因中的體細胞突變。本發明也涉及包含本發明的誘導型異源雙鏈產生子的試劑盒，所述試劑盒可用于分析基因組DNA序列的方法中。

背景技術

在生物體的基因組中檢測DNA序列變異的能力(為了方便起見，以下簡稱“多態性”，但沒有限制作用)，已經成為診斷疾病和病癥中、以及預測對治療方案的反應中的重要工具。使用早期變異檢測法，越來越可能在身體表現癥狀之前就診斷和治療、甚至預防疾病或病癥的發生。而且，變異檢測法可成為有用的研究工具，因為它可導致發現病癥的遺傳基礎，而所述的病癥原因迄今不為人所知或被認為是非遺傳性的。

序列變異可以是很多不同的形式。例如，可以通過在基因的特定位點上將一個或多個核苷酸殘基取代為數目相同的其它核苷酸來產生變異。另一個實例是在基因的特定位點上缺失一個或多個核苷酸。另一個實例是在基因的特定位點上插入一個或多個額外的核苷酸。也可以是取代、缺失和插入的組合。序列變異的常見類型是單核苷酸多態性或SNP。SNP涉及在基因的特定位點上一個核苷酸殘基對另一個核苷酸的取代。雖然每個SNP僅涉及一個核苷酸，但是單個基因可包含很多SNP。

鑒定物種或者該物種的個體的特定基因是否含有序列變異，稱為基因型分型。所以，全長測序是實現基因型分型的方法，但其耗時耗力并且效率極低。

在現有技術中已知的可選擇性基因型分型法利用了所謂的誘導型異源雙鏈產生子(以前也稱為通用異源雙鏈產生子，并在下文中用術語“IHG”來指代)。它們是模擬基因組DNA序列的合成DNA序列，但其含有與在基因組DNA內已知的多態性位點相對的核苷酸位置上和(在現有技術中)與之相鄰的(即直接相鄰)核苷酸位置上遺傳工程化引入的受控的核苷酸取代、缺失、插入或其組合(統稱為“識別標記(identifier)”)。為了檢測基因組DNA中的序列變異，分別用相同的基因座特異性PCR引物來擴增IHG和基因組DNA序列，隨后通過加熱和緩慢冷卻來使相應的PCR產物彼此雜交來產生DNA異源雙鏈。然后，例如通過非變性的聚丙烯酰胺微型膠電泳，來分辨(resolve)所產生的異源雙鏈。根據在IHG和基因組DNA之間錯配的數目、類型和位置，產生以不同速率遷移的不同異源雙鏈，因此產生了不同等位基因的特征性條帶圖。

下列參考文獻論述了誘導型異源雙鏈產生子的用途：

1.Bidwell,JL,Clay,TM,Wood,NAP,Pursall,MC,Martin,AF,Bradley,BA?and?Hui,KM(1993)Rapid?HLA-DR-Dw?and?DP?matching?by?PCR?fingerprinting?and?related?DNA?heteroduplex?technologies,pp99-116in:Handbook?of?HLA?Typing?Techniques[Eds?KM?Hui&JL?Bidwell]CRC?Press:Boca?Raton,Florida.

2.Wood,N,Tyfield,L,Bidwell,J(1993)Rapid?classification?of?phenylketonuria?genotypes?by?analysis?of?heteroduplexes?generated?by?PCR-amplifiable?synthetic?DNA.Human?Mutation2:131-137.