[發明專利]海南毒素?IV類似物rHNIV?01的表達載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201410330373.5
• 申請日: 2014-07-11
• 公開（公告）號: CN104099362B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 孟爾;張東裔;張輝;鮑邵衡;李文穎;吳磊;朱凌云;柳瓏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍國防科學技術大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達載體及其制備方法。

背景技術

肽類藥物由于其選擇性高，體內無結存等特點，越來越受到各大制藥公司的青睞。特別是含有多對二硫鍵的多肽分子比線性多肽分子具有更加優秀的穩定性和吸收性，因此是藥物設計開發的一個熱點。天然海南毒素-IV(HNTX-IV)是從我國特有的海南捕鳥蛛里面分離到的一種神經多肽類毒素。它含有35個氨基酸，C端有酰胺化修飾，含有三對二硫鍵，且二硫鍵的配對是典型的ICK模體(Cys2-Cys17，Cys9-Cys24，Cys16-Cys31)。通過前期研究結果表明HNTX-IV能夠選擇性的高效抑制大鼠背根神經節(DRG)細胞上的河豚毒素敏感(TTX-S)型電壓敏感鈉通道(VGSC)電流。進一步的研究結果表明，HNTX-IV的結構中有一個富含正電荷的表面(Lys27，His28，Arg29，Lys32)，該表面對于HNTX-IV結合VGSC有重要的作用。為了更好的研究和開發HNTX-IV，使其直接成藥或者作為藥物先導分子開發，勢必需要制備一系列的HNTX-IV類似物以供研究。

rHNIV-01作為一種重要的HNTX-IV類似物，與天然HNTX-IV相比，僅在C端缺少酰胺化修飾，rHNIV-01對應的氨基酸序列為：ECLGFGKGCNPSNDQCCKSS?NLVCSRKHRWCKYEI(SEQ?ID?NO.11)。獲取rHNIV-01一般通過化學合成或者利用微生物進行異源表達。根據專利申請人多年的多肽制備經驗，氨基酸長度在30個以上，同時含有多對二硫鍵的小分子多肽，因需要反復的變復性(形成二硫鍵)和純化，導致其成本相當昂貴；利用微生物進行重組表達則成本相對低廉很多。通過微生物獲取工業級別的大量重組多肽，只能是通過大腸桿菌或者畢赤酵母。但是使用畢赤酵母，存在產物均一化程度不高的問題，而且相對大腸桿菌制備，有更高的技術門檻。目前還沒有使用大腸桿菌來制備rHNIV-01類似物的報道。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達載體。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

所述海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達載體的序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發明還提供了上述表達載體的制備方法，該方法是以pET-43a載體為模板，用SEQ?ID?NO.5—10所示的引物進行無縫克?。簩⒕幋aGST序列替換pET-43a載體中的NusA序列，同時將編碼SUMO序列插入編碼GST序列的下游，再將編碼rHNIV-01序列插入編碼SUMO序列ULP1酶切割識別位點的下游，得PCR產物；將PCR產物經DpnI消化后直接轉入大腸桿菌，優選大腸桿菌DH5α培養，提取質粒后經DNA測序驗證，即得rHNIV-01的表達載體，命名為pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ?ID?NO.4所示；其中所述編碼GST序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼SUMO序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼rHNIV-01序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發明還提供了上述述海南毒素-IV類似物rHNIV-01的制備方法，包括如下步驟：

(1)將上述表達載體pWE-rHNIV-01轉入大腸桿菌BL21，然后將大腸桿菌培養后進行rHNIV-01融合蛋白的誘導表達；

(2)將經步驟(1)誘導表達后的大腸桿菌菌體懸浮后破碎并離心，將離心所得上清液經透析并再次離心后用ULP1激酶消化，得消化產物；

(3)向消化產物中加入質量百分比濃度為6—8％的TCA，抽提rHNIV-01融合蛋白，得到rHNIV-01融合蛋白溶液，經透析后冷干保存；

(4)將步驟(5)所得凍干保存的透析產物經RP-HPLC純化后得純化后的rHNIV-01。

本發明還提供了一種用于制備上述表達載體的試劑盒，所述試劑盒包括SEQ?ID?NO.5—10所示的引物。

本發明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領域的常規操作技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：