[發明專利]海南毒素?IV類似物rHNIV?01的表達載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201410330373.5
• 申請日: 2014-07-11
• 公開（公告）號: CN104099362B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 孟爾;張東裔;張輝;鮑邵衡;李文穎;吳磊;朱凌云;柳瓏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍國防科學技術大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司43113
• 代理人: 盧宏

1.一種海南毒素-IV類似物rHNIV-01的表達載體，其特征在于，所述表達載體序列如SEQ?ID?NO.4所示。

2.如權利要求1所述表達載體的制備方法，其特征在于，所述方法是以pET-43a載體為模板，用SEQ?ID?NO.5—10所示的引物進行無縫克隆：將編碼GST序列替換pET-43a載體中的NusA序列，同時將編碼SUMO序列插入編碼GST序列的下游，再將編碼rHNIV-01序列插入編碼SUMO序列ULP1酶切割識別位點的下游，得PCR產物；將PCR產物經DpnI消化后轉入大腸桿菌培養，提取質粒后經DNA測序驗證正確，即得rHNIV-01的表達載體，命名為pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ?ID?NO.4所示；其中所述編碼GST序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼SUMO序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼rHNIV-01序列如SEQ?ID?NO.3所示。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。

4.如權利要求1所述海南毒素-IV類似物rHNIV-01的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)將權利要求1所述的表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)，然后將大腸桿菌培養后進行rHNIV-01融合蛋白的誘導表達；

(2)將經步驟(1)誘導表達后的大腸桿菌菌體懸浮后破碎并離心，將離心所得上清液經透析并再次離心后用ULP1激酶消化，得消化產物；

(3)向消化產物中加入質量百分比濃度為6—8％的TCA，抽提rHNIV-01融合蛋白，得到rHNIV-01融合蛋白溶液，經透析后冷干保存；

(4)將步驟(5)所得凍干保存的透析產物經RP-HPLC純化后得純化后的rHNIV-01。

5.用于制備權利要求1所述表達載體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SEQ?ID?NO.5—10所示的引物。