[發(fā)明專利]基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410329652.X
• 申請日: 2014-07-11
• 公開（公告）號: CN104099253A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設計）人: 石貴陽;王寶石;張杰;胡志杰;蔣小東;孫福新;李贏;張梁;李由然;丁重陽;顧正華
• 申請（專利權）人: 江南大學;宜興協(xié)聯(lián)生物化學有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/48;C12R1/685
• 代理公司: 無錫華源專利事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶漢欽

技術領域

本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術領域，尤其是涉及一種基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)方法。

背景技術

檸檬酸（Citric?Acid）又名枸櫞酸，化學名稱是2-羥基丙烷三羧酸，無色晶體，常含有一分子結(jié)晶水，無臭，具有很強的酸味，易溶于水，在冷水中比熱水中更容易溶解，常用來鑒定和分離。在食品化妝醫(yī)藥、建筑、印染、洗滌等行業(yè)具有廣泛的用途，因其具有令人愉悅的酸味，入口爽快，無后酸味，安全無毒，已成為當前世界上生成量和消費量最大的食用有機酸。檸檬酸在新興行業(yè)的應用需求呈現(xiàn)出逐漸增長的趨勢。檸檬酸在環(huán)境可持續(xù)發(fā)展方面有廣泛應用，可以有效清除焊接殘留，在生物聚合物、藥物運輸、組織工程中培養(yǎng)細胞方面也具有巨大的潛力。

檸檬酸發(fā)酵普遍采用黑曲霉二級發(fā)酵方式，即首先培養(yǎng)成熟的種子，然后成熟的種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)。傳統(tǒng)種子培養(yǎng)過程是采用黑曲霉孢子接種方式，需要大量成熟的黑曲霉孢子，黑曲霉孢子制備過程比較復雜。一批成熟的黑曲霉孢子需要經(jīng)過平板篩選，斜面培養(yǎng)，茄子瓶培養(yǎng)，最后麩曲桶培養(yǎng)等逐級擴大培養(yǎng)過程，制備過程繁瑣，活性篩選復雜，工作量大，制備周期需要30d以上。同時，采用孢子接種方式培養(yǎng)種子工藝，僅孢子萌發(fā)需要至少12h，因而成熟種子培養(yǎng)時間較長。

傳統(tǒng)黑曲霉孢子逐級擴大培養(yǎng)過程存在流程長且復雜、篩選工作量大、周期長等缺點，需要消耗大量的原料成本以及運行成本。因而，如何改進黑曲霉孢子制備過程，縮短成熟種子培養(yǎng)時間，降低生產(chǎn)成本，是檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)亟待解決的一個重要問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)方法，能直接減少黑曲霉孢子繁瑣的培養(yǎng)過程，同時可以有效縮短成熟種子培養(yǎng)時間，提高原料利用率。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種基于菌絲球分散技術的檸檬酸黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）將黑曲霉孢子液接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)20~32h，制備成熟的種子液；

（2）成熟的種子液經(jīng)過分散器處理，得到分散菌絲種子液；?

（3）將步驟（2）得到的部分分散菌絲種子液以5~15%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，當發(fā)酵培養(yǎng)基還原糖濃度低于0.5%時發(fā)酵結(jié)束；

（4）將步驟（2）得到的部分分散菌絲種子液以5~15%（v/v）接種量接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)16~24h，制備得到下一級成熟的種子液，然后回到步驟（2），即實現(xiàn)黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)。

步驟（1）中接種后黑曲霉孢子液濃度為40~55萬個/ml接種。步驟（1）和步驟（4）中的種子培養(yǎng)基的總糖8~12%，總氮0.15~0.4%。

步驟（2）中成熟的種子液經(jīng)過分散器處理，菌體的菌球或菌塊平均直徑40~100um。步驟（3）中的發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖14~16%，總氮0.05~0.15%。

所述種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉質(zhì)原料液化液配制的培養(yǎng)基，原料包括玉米粉，木薯，紅薯。其他菌絲經(jīng)過分散處理的微生物發(fā)酵，均適用本技術。

本發(fā)明有益的技術效果在于：

傳統(tǒng)的檸檬酸生產(chǎn)菌種的黑曲霉孢子逐級擴大培養(yǎng)存在流程復雜、周期長、孢子活力篩選工作量大、種子培養(yǎng)周期長等問題，本發(fā)明基于菌絲球分散技術，采用分散菌絲替代傳統(tǒng)孢子接種實現(xiàn)黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)，直接減少傳統(tǒng)種子培養(yǎng)方式中孢子逐級擴大培養(yǎng)工藝，縮短種子培養(yǎng)周期，降低原料與能量消耗；同時分散菌絲顆粒纏繞的菌絲較稀薄，利于傳質(zhì)與溶氧，提高糖酸轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

（1）黑曲霉種子連續(xù)培養(yǎng)，直接減少孢子逐級擴大培養(yǎng)過程，減少此過程的原料消耗成本與運行成本；

（2）采用分散的菌絲接種培養(yǎng)種子液，直接縮短孢子接種方式的孢子萌發(fā)時間，減少成熟種子培養(yǎng)時間，減少過程運行成本；

（3）與傳統(tǒng)菌絲球接種發(fā)酵相比，采用相對分散的菌絲接種發(fā)酵方式，增大與介質(zhì)接觸的比表面積，利于傳質(zhì)與溶氧，提高糖酸轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明中種子連續(xù)培養(yǎng)10批次以上，從種子發(fā)酵結(jié)果看，糖酸轉(zhuǎn)化率≥98%，發(fā)酵周期60~70h，檸檬酸發(fā)酵水平正常。

具體實施方式