[發(fā)明專利]一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410328901.3
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104131012B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王曉波;邱麗娟;李冬冬;馬元山;張浩偉;高雅麗;張文明
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12Q1/68
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務(wù)所34116
• 代理人: 汪蕙

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種大豆的分子標記技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法。

背景技術(shù)

雄性不育系是作物雜種優(yōu)勢利用的極好材料，具有重要的理論價值和實際應(yīng)用價值，其研究成果可為應(yīng)用基因工程手段創(chuàng)新、改良不育系，解決育性穩(wěn)定等問題提供有理的理論依據(jù)。1993年吉林省農(nóng)科院孫寰等發(fā)現(xiàn)世界上第一個大豆細胞質(zhì)雄性不育系，目前，我國已實現(xiàn)了大豆的“三系”配套栽培，并對大豆的遺傳規(guī)律進行了深入的研究。大豆細胞質(zhì)雄性不育“三系”包括不育系、保持系和恢復(fù)系構(gòu)成，不育系做母本與恢復(fù)系父本雜交，可獲得雜交種。其中，保持系和恢復(fù)系由于自身可育，種子可由自交繁殖獲得，而不育系只能通過其作為母本，與同型的保持系父本雜交獲得種子。在田間繁殖過程中，常常由于田間種植、收獲脫粒等環(huán)節(jié)造成不育系中混雜保持系的后果，導(dǎo)致收獲的雜交種總因混入了不育系而導(dǎo)致純度下降，這樣的種子在生產(chǎn)上種植，必然導(dǎo)致減產(chǎn)，因此，大豆雄性不育系的早期鑒定顯得尤為重要。

中國專利文獻“一種分子標記鑒定大豆細胞質(zhì)雄性不育系種子純度的方法”(CN103160599A)提供了一種利用分子標記法鑒定大豆RN型細胞質(zhì)雄性不育系的方法，該方法以大豆RN型細胞質(zhì)雄性不育系種子的基因組DNA為模板進行PCR擴增，其中擴增后的不育系片段長度為200bp，保持系擴增后的片段長度為212bp，最終通過片段長度差異將不育系和保持系區(qū)分開，但該發(fā)明中，不育系和保持系擴增后的片段長度差異只有12bp，利用常規(guī)的凝膠電泳并不能非常準確地將兩者區(qū)分開來；此外，由于此方法針對的是大豆細胞質(zhì)不育系，目前尚無關(guān)于大豆細胞核雄性不育分子鑒定的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記及其鑒定方法，以提供一種簡單精確的大豆細胞核雄性不育系的分子鑒定方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟：

一種鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記，所述分子標記具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

一種利用上述分子標記鑒定大豆細胞核雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取大豆植物組織基因組DNA，以所述分子標記的核苷酸序列為模板設(shè)計引物，進行PCR擴增，獲得擴增片段；

(2)若上述步驟(1)中能夠獲得所述分子標記的核苷酸序列，則上述步驟(1)的大豆為細胞核雄性不育系大豆；若不能，則為細胞核雄性可育系大豆。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中，引物的核苷酸序列為：

上游引物：SEQ?ID?NO：2：5’GTTAGGTGGGTAGGTGAG3’；

下游引物：SEQ?ID?NO：3：5’ACATAGTGTCGGAGTGG3’；

利用上述優(yōu)選的特異性引物，以大豆植物組織基因組DNA為模板，進行PCR擴增，若能夠獲得長度為1239bp的擴增片段，則所述大豆為細胞核雄性不育系大豆，若不能獲得長度為1239bp的擴增片段，則為細胞核雄性可育系大豆，所述長度為1239bp的擴增片段即為所述分子標記的核苷酸片段。

優(yōu)選地，所述步驟(1)的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，起始退火溫度58℃，以后每循環(huán)降低0.3℃，退火時間為40s，72℃延伸90s，設(shè)38個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸15min。

優(yōu)選地，所述步驟(1)的大豆植物組織選自葉片、根尖、種子和種皮中的一種。

本發(fā)明的原理為：本發(fā)明首先利用QTL定位，將控制大豆細胞核雄性不育系育性的基因定位在一個很小的區(qū)間，根據(jù)QTL定位結(jié)果，該區(qū)間只有4個候選基因，通過對候選區(qū)間的4個候選基因進行遺傳多樣性的分析，最終開發(fā)出一條能夠用于鑒定大豆細胞核雄性不育系的分子標記基因，并在該分子標記的基礎(chǔ)上開發(fā)出一條可以用于檢測大豆及其后代育性的早期鑒定的引物，利用該對引物可在大豆開花前的任何時期實現(xiàn)對育種材料的雄性不育性的判斷，且準確率100％，因此可在育種早期剔除可育個體，提高了大豆雜交制種的效率，本發(fā)明為大豆雜種優(yōu)勢的利用提供了一種高效的檢測方法。