[發明專利]一種熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410328648.1
• 申請日: 2014-07-10
• 公開（公告）號: CN104151301A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 黃志紓;譚嘉恒;吳偉彬;陳碩斌;胡命豪
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07D405/04
• 分類號: C07D405/04;G01N21/64
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明涉及探針，更具體地，涉及一種熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術

G-四鏈體(G-quadruplex)是一種特殊的DNA二級結構。人類基因組中很多富鳥嘌呤區域具有形成這一結構的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復序列，以及多種基因的啟動子區域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰島素基因等。G-四鏈體結構具有多態性，鏈的數量和取向、loop的連接方式以及鳥嘌呤的糖苷扭轉角以及與羰基負電中心配位的金屬離子等多方面決定了G-四鏈體的類型和構象，這些差異性也為蛋白和小分子化合物提供了多個識別位點。根據鏈的取向不同，G-四鏈體分為正平行，反平行與混合型三種構象。

G-四鏈體結構的形成對于體內的一系列生理過程都存在調控作用。研究證明，某些啟動子區域的G-四鏈體結構會顯著影響基因的轉錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結構被認為是起到分子開關的功能，其形成和拆散可能涉及到信號傳導、細胞凋亡和細胞增殖等一系列體內重要的生理過程。所以，在體內或者體外試驗中，能夠特異性地檢測出G-四鏈體結構的存在或者形成，對于研究G-四鏈體結構的相關生物學功能以及開發以G-四鏈體結構為靶點的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。

目前，在體內和體外檢測G-四鏈體結構的研究都取得了一些進展。由于體內大大過量的雙螺旋DNA的存在，以及復雜的細胞內環境，使得體內的檢測相對于體外檢測需要解決更多的難題，目前已有一些熒光分子可以實現體內G-四鏈體結構的檢測。而目前能夠對G-四鏈體構象進行鑒定的探針非常少，體外實驗中檢測G-四鏈體構象主要是通過儀器的手段，比如圓二色譜法、核磁共振等方法，這些方法對儀器和技術操作的要求都較高，而且價格較昂貴，基本上不能普及使用。

近年來，香豆素母體被廣泛應用于生物、醫藥、香料、化妝品及熒光染料等領域。其苯并吡喃結構具有Stokes位移大、熒光量子產率高、以及光穩定性好等優點，使香豆素類結構成為熒光傳感器分子設計中的優秀候選熒光團。而申請人實驗室前期的工作中合成了一系列的三芳基咪唑類的化合物，其對正平行構象的G-四鏈體具有較好的選擇性和結合能力。申請人將香豆素結構融合到三芳基咪唑結構當中，得到了新型的G-四鏈體探針，該探針選擇性識別正平行構象的G-四鏈體。

發明內容

本發明提供一種熒光探針，其特征在于結構式為：

式中R₁選自F或N-甲基哌嗪基，R₂選自N-甲基哌嗪基。

一種如權利要求1所述的熒光探針的制備方法，其特征在于包括以下步驟：先用4-二乙胺基水楊醛與丙二酸二乙酯反應，得到化合物再將在POCl3的存在下與DMF反應，得到醛基香豆素中間體將溶于DMSO中，加入的N-甲基哌嗪和K2CO3，反應生成將與醛基香豆素中間體反應，得到最終探針化合物。

根據需求提供上述的熒光探針在檢測G-四鏈體結構中的應用。

跟進一步的提供一種檢測G-四鏈體結構的方法，包括如下步驟：

1)將待測DNA溶于PH值7.2-7.4的緩沖液，得到溶液A；將所述探針溶解，再用PH值7.2-7.4的緩沖液稀釋，得到溶液B；

2)將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與探針的摩爾比為1～10，混合后對混合液進行熒光光譜分析，或者在紫外燈下進行肉眼觀察，判斷待測DNA是否為正平行構象的G-四鏈體結構；判斷方法如下：

(a)在紫外燈下進行肉眼觀察時，與溶液B對比，若混合液在紫外燈下通過肉眼觀察到熒光增強，則待測DNA為正平行構象的G-四鏈體結構；

(b)對混合液進行熒光光譜分析時，與溶液B相比，若混合液的熒光發射強度增強，則待測DNA為正平行構象的G-四鏈體結構。

判斷方法(b)中，與溶液B相比，若混合液的熒光發射強度增強30～200倍，則待測DNA為正平行構象的G-四鏈體結構。

所述緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液。

所述探針用二甲基亞砜溶解。

溶液A和溶液B的混合反應時間為1分鐘。