[發明專利]一種誘導楸樹體細胞胚發生的方法

有效

• 申請號: 201410327692.0
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104041418A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 王鵬;楊如同;李亞;馬玲玲;汪慶;李林芳
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種生物工程技術的方法，尤其涉及一種植物組織培養技術，具體為楸樹體細胞胚的誘導發生。

背景技術

楸樹(Catalpa?bungei)為紫葳科(Bignoniaceae)梓屬(Catalpa)高大喬木，原產中國，已有2000多年的栽培歷史。楸樹樹體高大挺拔，樹冠濃密，枝、葉和花都具有很高的觀賞價值，其木材質地堅韌致密，不易蟲蛀、耐磨、耐腐、隔潮，具有極高的經濟價值，在中國豐富的樹木資源中，惟其“材”貌雙全，自古素有“木王”之美稱。楸樹的適應性強，分布于我國東起海濱，西至甘肅，南始云南，北到長城的廣大區域內，是可以大面積栽培的優良珍貴的用材樹種。近年來楸樹病蟲害比較嚴重，限制了楸樹的大面積推廣。因此利用轉基因技術培育抗病蟲楸樹新品種對楸樹人面積的推廣具有重要的意義。

高頻率的再生體系是轉基因技術的關鍵技術之一。目前，楸樹的再生體系主要以器官發生途徑為主，但該體系產生的嵌合體較多。體細胞胚胎發生是在離體培養條件下，植物離體培養的細胞、組織、器官可以產生類似于胚的結構，其形成過程也經歷一個類似于胚胎發生和發育的過程。在木本植物上，體細胞胚胎發生的研究始于上世紀70年代后期，在80年代后期得到了迅猛發展。近年來，隨著分子生物學技術的迅猛發展及其在體細胞胚胎研究中的應用，植物體細胞胚胎發生技術不僅成為植物快速繁殖的最重要的手段，而且已發展成為植物胚胎發生機理、遺傳轉化的重要系統。目前關于楸樹體細胞胚誘導的研究還鮮有報道。

發明內容

本發明的目的是為楸樹利用轉基因技術培育抗病蟲的新品種提供一個成熟的再生體系。

本發明是通過以下實驗步驟實現的：

(1)楸樹成熟種子處理

將楸樹成熟的種子用紗布包好后用自來水沖洗30min，接著75％酒精表面滅菌60s，無菌水沖洗2次后用0.1％氯化汞溶液滅菌12min，無菌水沖洗6次。接種時剪開紗布，將種子兩端邊緣種皮略微剪破接種。

(2)愈傷組織誘導

將處理過的楸樹種子平鋪于1/2MS+0.3-0.5mg·L玉米素+0.3～0.9mg·L吲哚乙酸的誘導愈傷的培養基上，培養基放置于溫度25～28℃，無光照的培養室中暗培養20d后獲得愈傷組織。

(3)愈傷組織的繼代增殖培養

將愈傷組織放置在相同的誘導愈傷的培養基上，在光強為1500lux，光照時間是12h/d，溫度25～28℃培養室中培養10d。

(4)體細胞胚的誘導

選擇淺黃色、緊致、表面上呈顆粒狀的愈傷組織，切成0.5×0.5×0.Scm的小塊，放置于MS+0.5-3.0mg·L激動素+0.05mg·L吲哚乙酸的誘導體細胞胚的培養基上，在光強為1500lux，光照時間是12h/d，溫度25～28℃培養室中誘導楸樹體細胞胚發生。

附圖說明

圖1：楸樹成熟種子處理后接入培養基。

圖2：楸樹成熟種子經暗培養20d后誘導的愈傷組織。

圖3：繼代增殖培養10d后的楸樹愈傷組織。

圖4：愈傷組織誘導30d后楸樹體細胞胚發生。

具體實施方式：

(1)楸樹成熟種子處理

將楸樹成熟的種子用紗布包好后用自來水沖洗30min，接著75％酒精表面滅菌60s，無菌水沖洗2次后用0.1％氯化汞溶液滅菌12min，無菌水沖洗6次。接種時剪開紗布，將種子兩端邊緣種皮略微剪破接種。接種時剪開紗布，將種子兩端邊緣種皮略微剪破接種。每瓶接3個種子，每處理30瓶，重復3次。

(2)愈傷組織誘導

將處理過的楸樹種子平鋪于1/2MS+0.3-0.5mg·L玉米素+0.3～0.9mg·L吲哚乙酸的誘導愈傷的培養基上，培養基添加蔗糖3％，調節PH＝5.8，培養基放置于溫度25～28℃，無光照的培養室中暗培養20d后獲得愈傷組織。

(3)愈傷組織的繼代增殖培養

將子葉上的愈傷切下放置在相同的誘導愈傷的培養基上，在光強為1500lux，光照時間是12h/d，溫度25～28℃培養室中培養10d。

(4)體細胞胚的誘導

選擇淺黃色、緊致、表面上呈顆粒狀的愈傷組織，切成0.5×0.5×0.5cm的小塊，放置于MS+0.5-3.0mg·L激動素+0.05mg·L吲哚乙酸的誘導體細胞胚的培養基上，培養基添加蔗糖3％，調節PH＝5.8，在光強為1500lux，光照時間是12h/d，溫度25～28℃培養室中培養30d獲得楸樹體細胞胚。