[發(fā)明專利]牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410326515.0
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN104087641A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱宏吉;馬力;王世鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;C07K1/34;A61P9/12
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 張宏祥

1.牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，牦牛皮的脫毛，即將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，在剪去折干牦牛皮上的毛后在60～80℃溫水中浸泡牦牛皮4～48h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成0.5×0.5cm的小塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18～-20℃冷凍保存；

步驟2，牦牛皮的脫脂，即將步驟1脫毛的牦牛皮置于5wt％～20wt％正丁醇的水溶液中(即在溶液中，正丁醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5—20％)，在溶液溫度為0～10℃下連續(xù)攪拌4～48h，得到脫脂的牦牛皮，所述步驟1脫毛的牦牛皮與正丁醇的水溶液的質(zhì)量比為1：(5～20)；

步驟3，牦牛皮的除雜蛋白，即將步驟2脫脂的牦牛皮置于堿液中，在0～10℃下連續(xù)攪拌5～48h，得到除雜蛋白的牦牛皮，其中所述堿液為0.01～0.2M的氫氧化鈉水溶液或者氫氧化鉀水溶液，所述步驟2脫脂的牦牛皮與堿液的質(zhì)量比為1：(15～40)；

步驟4，牦牛皮的脫酸，即將步驟3除雜蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室溫20—25℃攪拌浸泡2～15h，再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到5～7，得到脫酸牦牛皮，其中所述酸液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.01％～2％的鹽酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步驟3除雜蛋白的牦牛皮與酸液的質(zhì)量比為1：(5～15)；

步驟5，對脫酸牦牛皮進(jìn)行抽提，即將步驟4脫酸的牦牛皮置于70～90℃的熱水中攪拌抽提，所述步驟4脫酸的牦牛皮與熱水的質(zhì)量比為1：(5～15)，在攪拌抽提過程中每隔30～120min進(jìn)行過濾并更換熱水繼續(xù)進(jìn)行攪拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次過濾得到的濾液匯總成為水抽提產(chǎn)物；

步驟6，將水抽提產(chǎn)物制備明膠粉末，即將步驟5得到的水抽提產(chǎn)物(即牦牛皮全部溶解后得到的全部膠液)在4000～10000g離心力下離心2～20min，收集上清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后干燥得到明膠粉末，2～4℃儲存?zhèn)溆茫?!-- SIPO -->

步驟7，對明膠粉末進(jìn)行酶解，即將步驟6制備的明膠粉末溶于0.01～0.2M的磷酸鈉緩沖溶液中以得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4～10％的明膠水溶液，加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，加酶量為底物(即明膠粉末)重量的0.1～2％，酶解溫度為35～55℃，酶解時間4～8h，pH值為7；酶解后置于75～90℃滅酶處理5～15min；滅活后，在4000～10000g離心力下離心15～40min，保留上清液；

步驟8，將步驟7制備的上清液進(jìn)行超濾以得到所需分子量的膠原蛋白溶液，其中選擇使用超濾膜進(jìn)行超濾，分別使用分子量為10kDa及3000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量為小于10kDa和3000Da的膠原蛋白溶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，在步驟2中，所述正丁醇濃度優(yōu)選10—20％，溫度為5～10℃，時間為20～40h；在步驟3中，所述堿液為氫氧化鈉的水溶液，摩爾濃度為0.01M，除雜溫度為2～6℃，時間為15—40h；在步驟4中，所述酸液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.01％～2％的鹽酸水溶液，在室溫20—25℃攪拌浸泡10～15h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，在步驟6中，在濃縮后進(jìn)行的干燥為冷凍干燥或者噴霧干燥。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，在完成步驟8的超濾之后，進(jìn)行離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相色譜等方法進(jìn)行分離純化多肽，濃縮干燥，以得到膠原蛋白多肽的粉末。