[發(fā)明專利]重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白STp5?His、抗該蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410325521.4
• 申請日: 2014-07-09
• 公開（公告）號: CN104031152B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 師東方;韓林林;包軍;董秀梅;朱妍;張萍;劉文鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K16/18;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12N5/20;G01N33/577;A61K39/395;A61P31/04;C12R1/19;C12R1/91
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白及其應(yīng)用，具體涉及豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素STp基因(estp)經(jīng)過4次串聯(lián)后表達(dá)出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp具有了良好的免疫原性，本發(fā)明屬于基因工程及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic?Escherichia?coli,ETEC)是引起幼畜、兒童和旅行者腹瀉的主要病原菌，是造成新生仔豬、犢牛腹瀉的重要病原之一。在家畜中，尤其以初生幼畜特別易感，可造成生長發(fā)育遲緩、生產(chǎn)能力低下、嚴(yán)重的可以導(dǎo)致死亡，給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。ETEC毒力因子包括黏附素、腸毒素、水腫病毒素、內(nèi)毒素、溶血素以及EatA等。其中，腸毒素在ETEC的致病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。腸毒素包括：耐熱腸毒素(heat-stable?enterotoxin,ST)和不耐熱腸毒素(heat-labile?enterotoxin,LT)，其中ST是造成嚴(yán)重腹瀉的主要毒力因子之一。?

根據(jù)ST的生物學(xué)特性可將其分為：STI(或STa)和STⅡ(或STb)兩類。STa能引起新生仔豬(1～3日齡)和乳鼠腸積水，可導(dǎo)致兒童發(fā)生腹瀉；STb只能引起斷乳小豬和兔的腸積水，對乳鼠沒有致病性。STa在ST引起的腹瀉病中占主要地位。根據(jù)來源不同，STa分為豬/牛源(STp)和人源(STh)。STp與STh結(jié)構(gòu)相似，有14個氨基酸殘基及3個二硫鍵相同，成熟的STp有18個氨基酸，成熟的STh有19個氨基酸，二者在抗原性上沒有差別，能通過基因探針加以識別。由于STa分子量小(約2Ku)，很難獲得天然純品，且此蛋白不具有免疫原性。STa無法被蛋白質(zhì)染色劑染色，也不能直接包被到ELISA板上，因此無法采用SDS-PAGE法和ELISA方法對其進(jìn)行直接檢測，給臨床ETEC的檢測帶來很大困難。由ETEC引起的腹瀉疾病中，ST發(fā)揮重要作用，據(jù)Rebertson的調(diào)查研究表明：20％～30％的ETEC為LT+/ST-；30％～40％的ETEC為LT+/ST+；接近50％的ETEC為LT-/ST+。?也就是說在大部分的ETEC引起的嚴(yán)重腹瀉中，均有ST的存在，所以對ST進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測有利于對腹瀉病的早期診斷，采取有效治療方案，降低經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計，STp是造成新生仔豬和犢牛腹瀉，甚至死亡的重要毒力因子之一。?

目前對STa的檢測方法是乳鼠灌胃法。將新生BALB/c乳鼠(1～3日齡)隨機(jī)分組，將細(xì)菌過夜培養(yǎng)物上清中加入2％的伊文斯藍(lán)10μl/ml。每只乳鼠灌飼0.1ml，25℃靜止4h后，腹部解剖后取全部腸管，計算灌胃后乳鼠的G/C(腸重/剩余尸重)值進(jìn)行結(jié)果判定，當(dāng)G/C值≥0.09時，判為STa陽性，G/C值≤0.083時，判為STa陰性，兩者之間判為可疑。該方法與血清學(xué)方法相比敏感性較低，需要特定的實驗動物，操作繁瑣，不利于實驗室對STa的快速檢測。因此，制備針對STa的特異性抗體，建立快速、敏感、特異的血清學(xué)檢測方法對深入開展ETEC相關(guān)研究具有重要的理論和實際意義。?

由于STa蛋白較小，免疫原性差，單獨(dú)免疫后無法刺激動物體產(chǎn)生相應(yīng)抗體。雖然通過化學(xué)方法提純可以獲得品質(zhì)較高的STa蛋白，但純化工藝復(fù)雜，樣品損失量大，因此獲得具有免疫原性的STa蛋白是制備特異性抗體的前提。目前主要有兩種方法獲得具有免疫原性的STa蛋白：?