[發(fā)明專利]穩(wěn)定表達人MATE1轉(zhuǎn)運體的細胞模型的構(gòu)建及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410325014.0
• 申請日: 2014-07-09
• 公開（公告）號: CN104212834A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雷紅梅;孫思源;李麗萍;涂美娟;王凱;白夢如;周慧;曾蘇;蔣惠娣
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種構(gòu)建pcDNA3.1（+）-hMATE1重組質(zhì)粒的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)：先從冰凍人腎臟組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA文庫，通過設(shè)計含有Hind?Ⅲ和KpnⅠ兩個酶切位點的特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2所示，以該cDNA為模板特異性擴增獲得人SLC47A1基因的編碼區(qū)域片段，得到的目的基因片段通過Hind?Ⅲ和KpnⅠ兩個酶切位點連接到表達載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-hMATE1重組質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重組質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達hMATE1的MDCK-hMATE1細胞模型的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細胞48小時后，在培養(yǎng)基中加入400μg/ml的潮霉素B進行抗性篩選，持續(xù)篩選兩周后，通過有限稀釋法挑選培養(yǎng)單克隆細胞，經(jīng)過熒光底物DAPI初步篩選過量表達hMATE1的單克隆，采用Real-Time?PCR?法進行mRNA水平驗證并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參進行hMATE1?mRNA的相對含量測定，GAPDH和hMATE1各自的上、下游引物序列如SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4和SEQ?ID?No：5、SEQ?ID?No：6所示，MDCK-hMATE1細胞模型通過對經(jīng)典底物MPP⁺和二甲雙胍在有或無陽性抑制劑西咪替丁存在下的攝取能力進行功能確證。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的穩(wěn)定表達hMATE1的MDCK-hMATE1細胞模型在高通量快速篩選MATE1底物和抑制劑中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，底物篩選通過以下步驟實現(xiàn)：在待研究藥物孵育前，先用添加30mmol/LNH₄Cl的人工攝取緩沖液孵育20min，換成AUB繼續(xù)孵育5min，完成前兩步預(yù)孵育后方進行待研究藥物的孵育，在MDCK-pcDNA3.1和MDCK-hMATE1細胞同時進行待研究藥物孵育相同時間的實驗，若待研究藥物在MDCK-hMATE1細胞上的積聚量超過mock細胞上積聚量的2倍，則可認為待研究藥物是MATE1的底物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，抑制劑篩選通過以下步驟實現(xiàn)：在待研究藥物孵育前，先用添加30mmol/LNH₄Cl的AUB孵育20min，換成AUB繼續(xù)孵育5min，完成前兩步預(yù)孵育后方進行待研究藥物的孵育，MPP⁺、二甲雙胍作為MATE1的經(jīng)典底物，分別與不同濃度的待研究藥物共孵育，通過檢測藥物對細胞內(nèi)MPP⁺或二甲雙胍積聚量的影響，計算待檢測藥物對MPP⁺或二甲雙胍的抑制率及IC₅₀值，MPP⁺和二甲雙胍都采用液質(zhì)聯(lián)用法進行測定。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重組質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達hMATE1的MDCK-hOCT1/hMATE1細胞模型的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK-hOCT1細胞，挑選獲得單克隆的方法、熒光底物DAPI的篩選方法與獲得MDCK-?hMATE1細胞模型的方法相同，以GAPDH為內(nèi)參進行hMATE1?mRNA的相對含量測定時，同時測定細胞中hOCT1?mRNA的相對含量，GAPDH、hMATE1及hOCT1各自的上、下游引物序列如SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4，SEQ?ID?No：5、SEQ?ID?No：6及SEQ?ID?No：7、SEQ?ID?No：8所示，MDCK-hOCT1/hMATE1細胞進行MPP⁺的攝取實驗驗證功能，進行MDCK-hOCT1/hMATE1單層細胞對西咪替丁的轉(zhuǎn)運能力驗證實驗，在costar轉(zhuǎn)運板的給藥池加入20μmol/L西咪替丁，每20min在接收池取100μL緩沖液進行含量測定，轉(zhuǎn)運實驗進行2hrs，西咪替丁采用液質(zhì)聯(lián)用法進行測定。