[發明專利]一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法

有效

• 申請號: 201410324430.9
• 申請日: 2014-07-09
• 公開（公告）號: CN104164488B
• 公開（公告）日: 2016-11-02
• 發明（設計）人: 石超;馬翠萍;韓典昂;鄧美蓮
• 申請（專利權）人: 青島艾菲生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 陳磊

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，具體涉及一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法。

背景技術

核酸檢測已經廣泛應用于臨床診斷，環境監測以及傳染疾病的預防與控制等許多方面，聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction,PCR)能對微量核酸模板進行指數性擴增，其高靈敏度使其成為目前使用最廣泛的核酸擴增方法，然而，傳統PCR需要使用熱變性的方法制備單鏈核酸模板，使引物與模板退火，此過程需要具有精確調控溫的儀器。此外，PCR反應的特異性取決于引物退火的特異性，為了得到特異性的擴增，常常需要對退火溫度進行優化，工作較繁瑣。此外，PCR的產物也可以作為模板進行擴增，大量的產物極大的增加了污染的可能性，因此，對產物的處理要非常謹慎。為了克服上述傳統PCR費時、費力、工作繁瑣等的缺點，自20世紀90年代初以來很多實驗室嘗試發展無需熱變性的DNA等溫擴增技術。美國New?England?Biolabs的研究人員模擬生物體內DNA的復制機制發明了一種新的體外恒溫基因擴增技術--依賴于解旋酶恒溫基因擴增技術(Helicase?Dependent?Isothermal?DNA?Amplification,HDA)，此方法使用解旋酶將雙鏈核酸變成單鏈核酸，代替了傳統PCR的熱變性方法，使得整個反應可以在恒溫下進行，是一種恒溫條件下進行的PCR反應，不需要溫度的反復調控，省時、省力。但是此過程需要加入打開雙鏈核酸的解旋酶、使核酸保持單鏈狀態的單鏈DNA結合蛋白(SSB)和聚合酶，導致檢測費用增加。1992年美國Becton?Dickinson研究中心的Walker等首次報道鏈置換擴增技術(Strand?Displacement?Amplification,SDA)，其首先使用熱變性方法將雙鏈DNA轉變為單鏈，帶有限制性內切酶識別序列的引物與單鏈模板退火，聚合酶延伸形成模板的互補鏈，加入的外引物鏈置換下形成的模板互補鏈，另一個帶有限制性酶識別序列的引物與形成的模板互補鏈退火，延伸，實驗中使用硫代dNTP作為合成底物，使得內切酶只能裂解其中一條鏈，形成切口，聚合酶和內切酶共同作用進行指數擴增。此方法需要預先的熱變性過程，需要額外的加入硫代dNTP合成底物，增加了設計的復雜性和實驗費用。雖然后來切刻酶的發明解決了使用硫代dNTP合成底物來使內切酶裂解其中一條鏈的問題，節約了硫代dNTP合成的成本，但是需要設計四條引物和預先高溫變性的問題仍沒有解決。環介導等溫擴增技術(Loop?Mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)是由日本學者Notomi等于2000年建立的一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術，該技術是用4條特異性引物分別識別目標DNA的6個特定區域，通過2個環狀結構和鏈置換反應實現DNA的快速等溫擴增。LAMP反應過程包括啞鈴狀模板合成階段、循環擴增階段、伸長和再循環階段。其特別之處在于引物的設計，它包括2條內引物FIP、BIP及2條外引物F3、B3，其中兩條內引物在模板上延伸之后會自身形成莖環結構，兩條外引物在聚合酶延伸作用下，鏈置換下延伸的內引物。該方法反應迅速，一小時內可有效的擴增檢測1-10個拷貝的目的基因，特異性強，恒溫檢測，不需要特殊的儀器。但是此方法四條引物設計比較困難，對設計人員要求高，此過程雙鏈的解離需要依靠加入解鏈溫度調節劑，并且擴增的含有重復結構的大量產物易形成氣溶膠，造成假陽性結果。

發明內容

本發明為解決現有技術中所存在的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法，避免了現有的傳統恒溫檢測方法中需要預先通過變溫手段打開雙鏈核酸再進行擴增及引物設計復雜，檢測成本高等缺點。

本發明提供的技術方案為：

一種引發核酸恒溫擴增反應的單引物，引物至少含有a、b’、x、c四個區，其中b’區和a區的5’側相連，x區和b’區的5’側相連，c區和x的5’側相連；a區是和靶標核酸互補配對的核苷酸序列，b’區是與使用該引物延伸合成反應產物的3’末端區域互補的核苷酸序列，x區包含切刻酶的識別位點和切刻位點核苷酸序列，c區是利用其合成的互補核酸進行信號檢測的核苷酸序列；引物a區聚合延伸形成b區，形成的a+b區可在反應溫度下與模板核酸動態解離；引物延伸形成的b區與引物原有序列自身折疊互補配對，形成自身莖環結構；形成的莖環結構3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位點。