[發明專利]一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法

有效

• 申請號: 201410324430.9
• 申請日: 2014-07-09
• 公開（公告）號: CN104164488B
• 公開（公告）日: 2016-11-02
• 發明（設計）人: 石超;馬翠萍;韓典昂;鄧美蓮
• 申請（專利權）人: 青島艾菲生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 陳磊

1.一種引發核酸恒溫擴增的單引物，其特征在于：?

(1)引物至少含有a、b’、x、c四個區，其中b’區和a區的5’側相連，x區和b’區的5’側相連，c區和x的5’側相連；?

(2)a區是和靶標核酸互補配對的核苷酸序列，b’區是與該引物延伸合成反應產物的3’末端區域互補的核苷酸序列，x區包含切刻酶的識別位點和切刻位點核苷酸序列，c區是利用其合成的互補核酸進行信號檢測的核苷酸序列；?

(3)引物a區聚合延伸形成b區，形成的a+b區在反應溫度下與模板核酸動態解離；?

(4)引物延伸形成的b區與引物原有序列發生折疊互補配對，形成自身莖環結構；?

(5)形成的莖環結構3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位點。?

2.一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法，其特征在于：?

(1)引物的3’端a區與核酸模板近5’端的區域a’區退火；?

(2)聚合酶以退火后的引物的a區3’末端為合成起點，以核酸模板未發生互補配對的b’區為模板，進行合成反應；?

(3)步驟(2)產生的引物延伸產物可以在反應溫度下自身退火并和核酸模板發生解離，形成含有a區的環，而核酸模板又可重復參與步驟(1)中與引物的反應過程；?

(4)步驟(3)中形成了莖環結構的延伸產物以自身為模板，以與b’區退火的b區的3’末端為合成起點，合成其自身的互補鏈；?

(5)切刻酶在步驟(4)形成的延伸產物的X’區進行單核酸鏈的切刻，形成切口，聚合酶以切口5’側的X’區的3’末端為合成起點，以自身為模板，進行鏈置換合成反應，置換步驟(4)所合成的互補鏈c’；?

其中聚合酶在切刻形成的切口處進行聚合反應形成的產物和步驟(4)形成的產物一樣，可進行步驟(5)的反應，不斷循環置換產生互補鏈c’。?

3.如權利要求2所述的一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法，其特征在于：處理雙鏈核酸，得到權利要求2所述的核酸模板，包括：含有切刻酶切刻位點的雙鏈核酸,在聚合酶和切刻酶的共同作用下不斷產生含有特定區域的單鏈核酸模板分子。?

4.如權利要求2或3所述的任一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法，其特征在于：權利要求2所述核酸模板為DNA或RNA。?

5.如權利要求2或3所述的任一種單引物引發的核酸恒溫擴增方法，其特征在于：可在權利要求2所述的步驟(3)加入解鏈溫度調節劑促使引物延伸產物從模板解離。?

6.一種檢測目的核苷酸序列的方法，其特征在于：所述方法包括權利要求2或3所述的任一種擴增方法，還包括基于信號變化測定是否已產生權利要求2步驟(5)中產生的擴增反應產物。?

7.如權利要求6所述的檢測目的核苷酸序列的方法，其特征在于：所述信號變化是基于加入核酸檢測試劑，包括熒光檢測試劑、電化學檢測試劑、比色檢測試劑、化學發光檢測試劑。?

8.通過權利要求7所述的檢測方法檢測突變的方法，其特征在于：其中要被擴增的核苷酸序列中的野生型或突變至少一個在3’末端防止互補鏈的合成，其3’末端是構成擴增方法的互補鏈合成的起點，其中所述的3’端選自：引物a區的3’末端或權利要求2步驟(2)中合成的互補鏈b的3’末端。?

9.單引物引發的核酸恒溫擴增試劑盒，其特征在于：試劑盒包括以下組分：寡核苷酸引物，其至少包括權利要求1所述的a、b’、x、c區；催化鏈置換型互補鏈合成反應的DNA聚合酶；能夠特異的切刻雙鏈核酸其中一條核酸鏈的切刻酶；核苷酸，其作為聚合酶的底物。?

10.在同一反應體系檢測多個靶標核酸的方法，其特征在于：通過權利要求2所述的方法，在同一反應體系中至少含有兩條引物，通過至少一個檢測信號實現多個靶標核酸的同時分別檢測或多個靶標核酸的兼并性檢測。?