[發明專利]一種高效表達與制備外分泌型人源AFP的方法

有效

• 申請號: 201410320779.5
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104371017B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 歐文斌;孟凡國;嚴子琴;劉麗;胡衛江;劉俊
• 申請（專利權）人: 嘉興博泰生物科技發展有限公司;浙江清華長三角研究院
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/81;C07K1/30
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司33101
• 代理人: 翁霽明

1.一種高效表達與制備外分泌型人源AFP的方法，其特征在于該方法主要包括如下三個方面的內容：

(1) 利用基因合成技術合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學方法構建酵母重組表達質粒PpICZ α A-AFP，并進行質粒抽提；

(2) 使用畢赤酵母表達系統體外誘導表達分泌型AFP重組蛋白，并通過優化表達時間、誘導劑添加量條件得出最佳誘導條件；

(3) 優化硫酸銨分級沉淀, 從發酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的AFP重組蛋白，在55％硫酸銨濃度下目的蛋白AFP幾乎全部析出，且純度高達98.844％；

所述三個方面的內容中，分別包含有如下步驟：

第(1)方面的內容中包括如下步驟：

a. 利用基因合成技術，合成人源AFP序列；

b. 設計帶酶切位點的引物，通過PCR得到帶有雙酶切位點的AFP克隆質粒，并進行質粒提?。?/p>

第(2)方面的內容中包括如下步驟：

c.將b步驟中獲得的質粒通過雙酶切克隆到PpICZ α A載體中，構建PpICZ α A-AFP重組表達質粒，并進行質粒抽提；

d. 將c步驟中獲得的質粒進行線性化后電轉進入畢赤酵母GS115中，通過優化感受態細胞GS115濃度，獲取高轉染率，通過PCR鑒定挑取陽性克隆；

e. 將d步驟中挑取的陽性克隆同時用甲醇進行小量誘導表達，通過對甲醇添加量、誘導時間、菌密度表達條件的優化，獲得最佳誘導表達條件并獲取最佳表達重組菌；

f. 通過步驟e中實驗得出，甲醇濃度為0.5％，誘導表達第3天的重組蛋白的分泌量最大；

g. 通過前面實驗的基礎，再將表達體系擴大至2L，收集表達第3天的發酵上清液；

第(3)方面的內容中包括如下兩個步驟：

h. 將g步驟中獲得的發酵液通過硫酸銨分級沉淀純化蛋白，設計不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白；

i. 將h步驟中獲得的蛋白回溶后經透析，測其含量和純度得出目的蛋白在55％硫酸銨濃度下幾乎已全部析出，且經HPLC檢測其純度高達98.844％。