[發(fā)明專利]一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法

有效

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• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104371017B
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 歐文斌;孟凡國;嚴(yán)子琴;劉麗;胡衛(wèi)江;劉俊
• 申請（專利權(quán)）人: 嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司;浙江清華長三角研究院
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/81;C07K1/30
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司33101
• 代理人: 翁霽明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種體外重組高效表達(dá)制備具有生物活性AFP的方法，具體涉及利用分泌型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性的人源AFP重組蛋白的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)ORF全長1830bp，翻譯后蛋白含有609個(gè)氨基酸殘基，分子量約70kDa。AFP是一種腫瘤相關(guān)的單鏈糖蛋白，其糖鏈部分具有癌胚性變化的特征。AFP為胎兒時(shí)期肝臟合成的一種胚胎蛋白，出生后一周消失，以后完全被白蛋白替代。正常人不產(chǎn)生AFP，當(dāng)患肝細(xì)胞癌、卵黃囊和胚胎樣腫瘤及部分肝外腫瘤時(shí)機(jī)體可重新合成AFP，因此臨床上AFP被當(dāng)成一種肝癌及生殖細(xì)胞腫瘤的血清標(biāo)志物來使用。目前，肝癌檢查主要包括血清甲胎蛋白(AFP)和肝臟影像學(xué)檢查。檢測AFP是當(dāng)前診斷肝癌最簡便、靈敏、快捷的方法，現(xiàn)認(rèn)為它在發(fā)現(xiàn)早期肝癌方面有獨(dú)一無二的價(jià)值，在臨床上被認(rèn)為是肝癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物，因而被當(dāng)作診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)。

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是近幾年發(fā)展起來的較為完善的、被廣泛用來表達(dá)外源蛋白的甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)主要有以下優(yōu)點(diǎn)：1)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；3)營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)；4)在P.pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞內(nèi)，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化；5)糖基化程度低，與S.cerevisiae相比，P.pastoris不產(chǎn)生過度的糖基化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種能夠大規(guī)模制備具有生物活性且高純度的AFP的高效表達(dá)具有生物活性的AFP重組蛋白及其制備方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源AFP的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容：

(1)利用基因合成技術(shù)合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZ α A-AFP，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；

(2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型AFP重組蛋白，并通過優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；

(3)優(yōu)化硫酸銨分級沉淀,從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的AFP重組蛋白，在55％硫酸銨濃度下目的蛋白AFP幾乎全部析出，且純度高達(dá)98.844％。

本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述三個(gè)方面的內(nèi)容中，分別包含有如下步驟：

第(1)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟：

a.利用基因合成技術(shù)，合成人源AFP序列；

b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的AFP克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒提取；

第(2)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟：

c.將b步驟中獲得的質(zhì)粒通過雙酶切克隆到PpICZ α A載體中，構(gòu)建PpICZ α A-AFP重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；

d.將c步驟中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞GS115濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過PCR鑒定挑取陽性克隆；

e.將d步驟中挑取的陽性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過對甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間、菌密度等表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；

f.通過步驟e中實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5％，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最大；

g.通過前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液；

第(3)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟：

h.將g步驟中獲得的發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白；

i.將h步驟中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測其含量和純度得出目的蛋白在55％硫酸銨濃度下幾乎已全部析出，且經(jīng)HPLC檢測其純度高達(dá)98.844％。

本發(fā)明將純化得到的分泌重組蛋白AFP用臨床檢測電化學(xué)發(fā)光法檢測其生物活性，其值達(dá)3500ng/mL。

附圖說明

圖1是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒PpICZ α A的質(zhì)粒圖譜，

圖2是重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-AFP構(gòu)建的PCR鑒定圖，

圖3是酵母GS115重組菌株的菌落PCR鑒定圖，