[發明專利]一種來源于雞腸道的雌馬酚產生梭菌C1-6及應用

有效

• 申請號: 201410320599.7
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104087532A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 尹業師;方丹;王欣
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/06;A23K1/16;A23K1/18;C12R1/145
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及一種雌馬酚產生梭菌，特別涉及一種來源于雞腸道的雌馬酚產生梭菌C1-6的分離鑒定及應用。

(二)背景技術

腸道內的微生物復雜多樣，它們共同構成了一個動態平衡的微生態系統，然而同種動物消化道的不同位置所含微生物的數量和種類存在差異。對家禽腸道微生物的研究，目前主要集中在盲腸部位。有學者曾運用分子技術分析發現，雞盲腸內的微生物最為豐富，但問題是目前只有約10％的微生物是已知的物種，這使我們研究腸道微生物種類和作用產生局限性。另外，Zhu等人(Appl?Environ?Microbiol,2002,68,1:124-37)利用從雞盲腸內容物中篩選到的1656條16S?rRNA序列，分析發現在雞盲腸微生物中梭菌屬細菌是數量上最占優勢的細菌之一，其他大部分都是未知菌種，還需進一步研究。

梭狀芽孢桿菌由硬壁菌門中的革蘭式陽性桿狀細菌組成。大部分的梭狀芽孢桿菌都能產生內孢子，因此具有在惡劣條件下存活的生態優勢。盡管有些種類的梭菌會產生毒素類物質且具有致病性，但大部分的梭菌與宿主之間維持著共生關系。其中梭菌屬Ⅹ?Ⅳa簇和梭菌屬Ⅳ簇包含了多種梭形菌，它們構成了腸道微生物中總菌的10-40％，且能夠產生大量不同的酶類來降解宿主無法消化的各種多糖和寡糖類物質，這些復合物降解之后的產物包括乙酸，丙酸和酪酸。另外最新研究發現梭菌屬Ⅹ?Ⅳa簇和Ⅳ簇細菌在宿主免疫系統的調控中發揮著重要作用，一個由梭菌屬Ⅹ?Ⅳa簇和Ⅳ簇中的46株梭菌組成的混合劑，具有誘導大腸上皮淋巴細胞(intraepithelial?lymphocytes，IELs)T細胞受體和免疫球蛋白A(IgA)分泌細胞積累的作用，而且由這46株梭菌組成的混合劑還能影響CD4調節T細胞的數量和功能。因此分離培養雞腸道內的梭狀芽孢桿菌，進一步研究其功能顯得尤為重要。

雖然目前已有很多分子生物學技術用于腸道微生物的研究，比如基于16S?rRNA基因的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳技術(DGGE/TGGE)、原位雜交技術(FISH)、末端限制性片斷長度多態性分析(T-RFLP)以及實時熒光定量PCR技術(Real-time?PCR)，但傳統的體外純培養仍是研究腸道微生物的一種重要手段。目前，往往是將兩種方法結合起來使用。首先，利用不同的培養條件在體外純培養不同的細菌，再結合現有分子水平鑒定方法鑒定所分離得到的菌株種類，此方法快速準確又能得到純培養細菌，具有廣泛的應用前景。

對現有文獻和專利進行檢索發現，目前用于動物生產和飼料添加劑開發等的主要是丁酸梭菌。本實驗利用NEOGEN提供的梭菌培養基，通過分離篩選從雞盲腸內容物中分離到了一株新的梭狀芽胞桿菌，作為影響新生小雞腸道菌群定植的干涉組，為進一步研究其對小雞生長及健康狀態的影響做準備，將來也可為研制禽類微生態制劑、飼料添加劑等提供理論基礎和科學依據。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種新的雌馬酚產生梭菌(Clostridium?sp.)C1-6及其在催化大豆素產生S-雌馬酚中的應用，以及其在小雞飼養過程中促生長和抑制沙門氏菌定殖的應用。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一株新的雌馬酚產生梭菌(Clostridium?sp.)C1-6，保藏編號為CGMCC?No.9123，保藏日期2014年5月4日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

本發明還提供一種所述雌馬酚產生梭菌C1-6在轉化大豆素制備S-雌馬酚中的應用，具體為：將雌馬酚產生梭菌C1-6經擴大培養獲得的種子液以體積濃度5％的接種量接種至含大豆素的BHI液體培養基，在厭氧條件下，37℃培養48h后，將培養液分離純化(優選將培養液用乙酸乙酯進行液相萃取，取萃取層檢測S-雌馬酚含量)，獲得S-雌馬酚；所述BHI培養基終濃度組成為：蛋白胨10g/L、脫水小牛腦浸粉12.5g/L、脫水牛心浸粉5.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氫二鈉2.5g/L，溶劑為水，pH值為7.0；所述大豆素的初始濃度為50μg/ml。