[發(fā)明專利]一種檢測黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實時熒光tHDA試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410320294.6
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104087665A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈建箴;肖世極;吳淡森;付海英;周華蓉;黃金梅;黃勁龍;王小婷;張勝藍(lán)
• 申請（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/68;C12R1/67
• 代理公司: 北京律譜知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于體外診斷核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種在臨床樣本中檢測煙曲霉和黃曲霉感染的熒光tHDA(熱穩(wěn)定解旋酶依賴性恒溫擴(kuò)增)試劑盒。

背景技術(shù)

近年來，隨著腫瘤患者的增多、化療藥物、免疫抑制劑和廣譜抗生素的廣泛使用，特別的是在惡性血液性疾病、骨髓移植中，侵襲性真菌感染的發(fā)生率明顯增高，曲霉菌感染是僅次于念珠菌感染的侵襲性真菌感染且逐年上升。有研究表明肺部曲霉菌感染的病死率為40％，泛發(fā)性曲霉感染為病死率為90％。在反復(fù)運用氟康唑預(yù)防真菌感染的尸檢病例中曲霉已成為首要的致病菌，而在惡性血液病患者尸檢中發(fā)現(xiàn)曲霉菌感染率高達(dá)30％。在中國大陸的一項統(tǒng)計資料表明，在侵襲性曲霉感染中，煙曲霉與黃曲霉占86.82％，成為曲霉菌感染的主要病原菌(高露娟,余進(jìn),李若瑜.中國大陸地區(qū)曲霉病流行現(xiàn)狀分析[J].中國真菌學(xué)雜志,2010,04:247-251)。

對于侵襲性曲霉感染，早期診斷不僅能夠減少病死率，而且能夠減少醫(yī)療費用及住院天數(shù)，而目前，侵襲性曲霉菌感染的診斷主要依賴于傳統(tǒng)的實驗室診斷方法，包括：直接涂片鏡檢、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、組織病理學(xué)方法、影像學(xué)方法、血清學(xué)方法等，然而這些方法，每種方法均存在缺乏敏感性或特異性，而不能滿足臨床診療的需要。因此，以基因組DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷方法倍受關(guān)注，成為國內(nèi)外研究者的探索熱點。近來，研究人員報道了許多應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)(Real-time?PCR)檢測致病性真菌的特異核酸序列的研究，提出了實時定量PCR檢測方法可以很好地用來快速準(zhǔn)確地診斷侵襲性真菌感染。然而，實踐表明，實時定量PCR檢測方法存在著一些不足之處，例如:1)須要昂貴的PCR儀，尤其是實時熒光PCR儀造價不菲；2)多種因素影響擴(kuò)增效果；3)常引起非特異性擴(kuò)增，難以在基層推廣應(yīng)用等，亟待更新的方法來替代。

解旋酶依賴性恒溫核酸擴(kuò)增(helicase?dependent?amplification，HDA)，其原理是根據(jù)解旋酶在ATP存在下能夠解開DNA雙鏈，隨后兩條特異性引物結(jié)合于單鏈DNA并在DNA聚合酶的作用下催化合成雙鏈，并將此次合成的DNA雙鏈作為模版依次擴(kuò)增實現(xiàn)指數(shù)倍的擴(kuò)增。采用研究表明，HDA能很好地擴(kuò)增微生物基因組DNA、質(zhì)粒DNA和cDNA等。目前根據(jù)所采用的解旋酶的不同，可以分為1、室溫HDA，采用大腸桿菌解旋酶和Mutl蛋白在常溫下即可；2、熱穩(wěn)定HDA(thermophilic?helicase?dependent?amplification，tHDA)，從嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定解旋酶，此過程較室溫HDA相比不需要Mutl蛋白及單鏈結(jié)合蛋白(SSB)。本發(fā)明是采用tHDA作為擴(kuò)增方法，在較高的溫度下擴(kuò)增反應(yīng)可以減少非特異性擴(kuò)增，同時更有利于解旋酶進(jìn)行DNA解旋(CN03824150.1)。

作為一種嶄新的核酸擴(kuò)增方法，與普通PCR技術(shù)相比，該方法具有不需要經(jīng)過變性-退火-延伸的多次循環(huán)擴(kuò)增，可以簡化設(shè)備、降低成本更有利于在偏遠(yuǎn)地區(qū)的推廣運用的巨大優(yōu)勢。另外，較其他常見的恒溫擴(kuò)增技術(shù)也具有相應(yīng)優(yōu)勢，如：鏈替換擴(kuò)增(SDA)需要4條引物來實現(xiàn)早期擴(kuò)增，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)在轉(zhuǎn)錄、cDNA合成以及RNA降解過程需要三種酶來實現(xiàn)恒溫的擴(kuò)增。

實時熒光tHDA是tHDA技術(shù)與熒光定量技術(shù)的結(jié)合。僅利用tHDA擴(kuò)增技術(shù)對終產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，而實時熒光tHDA技術(shù)利用熒光信號的變化實時監(jiān)測HDA擴(kuò)增反應(yīng)中每一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值及其標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析能夠?qū)ζ鹗寄０暹M(jìn)行定量分析。但是，目前國際上對tHDA擴(kuò)增技術(shù)處于起步階段，雖現(xiàn)有利用tHDA擴(kuò)增技術(shù)運用于曲霉菌的檢測(王小婷.解旋酶依賴性DNA恒溫擴(kuò)增技術(shù)用于黃曲霉檢測的研究[D].福建醫(yī)科大學(xué),2012.)，但其敏感性較低，并且無法定量分析起始模板，目前國內(nèi)外尚未有將實時熒光tHDA技術(shù)運用于曲霉菌的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明首次建立起一種快速檢測曲霉菌的實時熒光tHDA技術(shù)，從而更有利于建立簡單便捷的臨床和實驗室診斷，也使對于基因?qū)用娴拇才詸z驗成為可能。

本發(fā)明的一個目的是提供一組作為引物使用的，能夠同時檢測出煙曲霉及黃曲霉的寡核苷酸序列。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種既快速、準(zhǔn)確，又易于標(biāo)準(zhǔn)化的能夠檢測煙曲霉及黃曲霉的實時熒光定量tHDA試劑盒。