[發明專利]一種檢測黃曲霉及煙曲霉的通用引物及實時熒光tHDA試劑盒

有效

• 申請號: 201410320294.6
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104087665A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發明（設計）人: 沈建箴;肖世極;吳淡森;付海英;周華蓉;黃金梅;黃勁龍;王小婷;張勝藍
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學附屬協和醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/68;C12R1/67
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

1.一組檢測煙曲霉及黃曲霉的通用引物，其特征在于，所述通用引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示。

2.一種檢測曲霉菌感染的實時熒光tHDA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分：

(1)DNA提取試劑；

(2)tHDA反應液，其中包括：tHDA緩沖液、MgSO₄、NaCl、dNTP、引物Ⅰ、引物Ⅱ，其中，所述引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，所述引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示；

(3)酶混合物，其中包括：熱穩定DNA解旋酶、Bst聚合酶和熱穩定性單鏈結合蛋白ET?SSB；

(4)熒光染料；

(5)陰性對照：為無插入煙曲霉或黃曲霉的特異性片段的pUC18-T載體質粒；

(6)陽性對照：為含有煙曲霉或黃曲霉DNA的樣本；；

(7)標準品：為插入有煙曲霉或黃曲霉的特異性片段的pUC18-T載體質粒；

(8)滅菌純水。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑包括：BufferⅠ，BufferⅡ，BufferⅢ，蛋白酶K，溶壁酶(lyticase)；所述熒光染料包括：EvaGreen?Dye和ROX?reference?Dye。

4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述標準品中插入的特異性序列如下：

GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTATTACTAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATAATGCTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTAATAGCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCCTTACTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTAACGCATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC。

5.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述標準品稀釋濃度為1×10⁸拷貝/ml、1×10⁷拷貝/ml、1×10⁶拷貝/ml、1×10⁵拷貝/ml、1×10⁴拷貝/ml、1×10³拷貝/ml。

6.一種檢測真菌感染的tHDA方法，用于對黃曲霉和/或煙曲霉感染進行檢測，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取樣品的DNA；

(2)以步驟(1)所得DNA為模版，利用權利要求1所述通用引物進行實時熒光tHDA擴增，該實時熒光tHDA擴增具體包括：

第一步：在61℃下預熱2min，然后61℃下擴增2min，并收集熒光，進行45個擴增循環，以獲得Ct值和擴增曲線；

第二步：使用實時熒光PCR儀器系統進行溶解曲線分析，以獲得相應溶解曲線。

(3)對分析結果進行判定，該步驟包括：

如果Ct值≤45并且＞0，并出現特定的S型擴增曲線，同時溶解曲線出現單一峰值，并且單一峰在退火溫度附近，則判定樣本中存在煙曲霉或黃曲霉，進而根據標準品所繪制的標準曲線，確定樣品中黃曲霉或煙曲霉的DNA拷貝數；

如果Ct值≤0，并且無擴增曲線，則判定樣本中無煙曲霉及黃曲霉；

如果陽性對照組中不出現特定的S型擴增曲線和/或Ct值，或者陰性對照中出現特定的S型曲線和/或Ct值，則判定此次擴增無效。

7.如權利要求6所述的tHDA方法，其特征在于，所述步驟(2)中的HDA擴增體系為：10×tHDA緩沖液5ul，DNA序列如SEQ?ID?NO：2所示的引物Ⅰ0.75ul、DNA序列如SEQ?ID?NO：2所示的引物Ⅱ0.75ul，模版DNA4ul，4mM?MgSO4、40mM?NaCl、0.4mM?dNTP、4mM?dATP、30U?Bst?DNA聚合酶、10ng熱穩定DNA解旋酶、25ng熱穩定性單鏈結合蛋白、2ul?EvaGreen?Dye、1ul?ROX?reference?Dye，加滅菌純水至50ul。