[發明專利]一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測試劑盒及其制備方法與應用無效

申請號：	201410319878.1	申請日：	2014-07-07
公開（公告）號：	CN104101705A	公開（公告）日：	2014-10-15
發明（設計）人：	乙引;洪鯤;萬晴姣;張宇斌	申請（專利權）人：	貴州師范大學
主分類號：	G01N33/569	分類號：	G01N33/569;G01N33/531
代理公司：	北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350	代理人：	湯東鳳
地址：	550001 貴州***	國省代碼：	貴州;52
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種 pmmov 貴州分離 id elisa 檢測試劑盒及其制備方法應用
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于酶學、免疫學或生物學技術領域，尤其涉及一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測試劑盒及其制備方法與應用。

背景技術

植物病毒病又被稱為“植物癌癥”，目前沒有有效的治療方法。對植物病毒病快速、準確的檢測有助于病株的早期發現、隔離和銷毀，也是植物抗病育種和脫毒苗的培育所必須的。診斷植物病毒的方法有傳統生物學方法、電鏡觀察法、血清學方法和分子生物學方法等。

血清學方法是檢測植物病毒最為常用和有效的手段之一。目前應用最廣泛的血清學檢測方法是酶聯免疫吸附法(ELISA)和斑點免疫結合測定法(DIBA)，DIBA法操作程序比ELISA法要簡單，但其檢測靈敏度低于ELISA法。

ELISA檢測方法的基本原理是：以酶催化的顏色反應指示抗原抗體的結合。利用酶標抗體、抗原或次抗原作為一個檢測體系，其靈敏度較高，可檢測到納克(ng)水平的病毒，并且可以減少檢測時間，進行大規模樣品調查，使常規病毒診斷變得非常容易，特別適合脫毒苗的檢測。目前，應用最多的是雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)和間接ELISA(ID-ELISA)等方法。

DAS-ELISA檢測法將已知抗體吸附于固相載體，加入待檢樣品(含相應抗原)與之結合，溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物，使抗體/抗原/酶標記抗體復合物與底物反應，呈現深淺不同的顏色反應。這種方法的優點：專業性強，靈敏度高、應用廣泛，在國外已形成商業化生產。但是DAS-ELISA存在一定的缺點：(1)檢測每種病毒都需要制備相應的酶標記特異性抗體，標記過程比較復雜，對技術和成本要求均高；(2)生產單克隆抗體存在雜交瘤細胞系的退化和某些雜交瘤細胞系在大鼠腹腔中不能誘生腹水的問題。

ID-ELISA檢測法將待檢樣品(含相應抗原)吸附于固相載體，加入第一抗體(抗血清)與之結合，溫育后洗滌，加入能識別第一抗體的酶標第二抗體和底物，使抗原/一抗/酶標二抗復合物與底物反應，呈現深淺不同的顏色反應。ID-ELISA的缺點：對病毒檢測的特異性和靈敏度比DAS-ELISA的要低；優點：(1)無需針對每種待檢病毒都制備相應的酶標記特異性抗體，降低成本和時間；(2)抗血清的制備方法容易，來源廣泛。

目前，國內未見有辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)特異性抗血清制備、ELISA檢測方法的建立和相應試劑盒制備的相關文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測試劑盒。

本發明的再一目的在于提供上述PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測試劑盒的制備方法，尤其是其中PMMoV特異性抗血清的制備方法。

本發明的另一目的在于提供上述PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測試劑盒在檢測辣椒PMMoV的檢測方面的應用，旨在解決辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)的血清學檢測尚屬空白的問題。

本發明是這樣實現的，一種PMMoV貴州分離物ID-ELISA檢測試劑盒，包括：陽性對照、陰性對照、PMMoV特異性抗血清、酶標二抗、顯色底物、封閉液、包被緩沖液、PBST洗滌緩沖液、抗體稀釋緩沖液、底物緩沖液以及96孔酶標板；其中，PMMoV特異性抗血清的制備包括以下具體步驟：

(1)根據GenBank中公布的PMMoV各地分離物的CP序列設計一對RT-PCR引物：

正向引物：5'-CTACCCATGGCATACACAGTTACCAGTG，

反向引物：5'-GGAATTCAGGAGTTGTAGCCCACGTAA；

(2)對感染PMMoV貴州辣椒分離物的組織進行RT-PCR擴增、純化以及回收，得到CP基因片段；

(3)將所述CP基因片段和原核表達載體pET32a(+)以Nco?I和EcoR?I兩種DNA限制性內切酶進行雙酶切處理、片段回收、連接、重組質粒轉化大腸桿菌、重組CP蛋白表達以及重組CP蛋白回收；

(4)將所述重組CP蛋白作為抗原免疫家兔制備特異性PMMoV抗血清，免疫后取兔血，即得到PMMoV特異性抗血清。