[發明專利]高產原花青素刺葡萄愈傷組織的獲取與繼代保持方法

有效

• 申請號: 201410319042.1
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104099287A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 賴呈純;范麗華;黃賢貴;謝鴻根
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業工程技術研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 宋連梅

技術領域

本發明具體涉及一種高產原花青素刺葡萄愈傷組織的獲取與繼代保持方法。

背景技術

刺葡萄(Vitis?davidii)是葡萄科葡萄屬東亞種群的一個野生種，為落葉強大藤本植物，在我國南方廣泛分布，向北分布至陜西南部。刺葡萄果實紫黑色，營養極為豐富，含有具保健功能的黃酮類化合物(主要是花青素和原花青素)、白黎蘆醇、齊墩果酸、蹂質、超氧化物歧化酶(SOD)和維生素C等天然活性成分。刺葡萄果皮厚，種子多，在加工制汁和釀酒，以及從果皮、種子提取天然活性物質具有很好的應用前景。研究表明，刺葡萄果實中富含的花青素和原花青素(oligomeric?proanthocyanidins，OPCs)有很強的清除自由基的能力，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、保護心血管等方面的功能，尤其是原花青素，是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑。目前，天然的原花青素還主要來源于松樹皮和葡萄籽，隨著市場需求的不斷擴大，原有的從葡萄、松樹皮或其他替代植物中來源的生物活性物質已不能滿足需要，必須尋求更多更可靠的材料來源。生物技術領域里一個重要分支的植物細胞培養，具有不受季節影響、生長周期短、產物均一可控、活性物質成分高于天然植物等優點，因此采用規?；闹参锛毎囵B是解決藥用植物資源匱乏和藥效成分低的藥用植物以滿足需求的重要途徑。

近年來，植物細胞培養進行天然有效成分的生產已經取得了令人矚目的成就。然而，刺葡萄的細胞培養還處在愈傷組織誘導和培養階段，鮮見長期繼代保持的報道；刺葡萄細胞培養還亟待解決細胞系的篩選、長期繼代保持和懸浮細胞系建立等諸多問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種高產原花青素刺葡萄愈傷組織的獲取與繼代保持方法。

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種高產原花青素刺葡萄愈傷組織的獲取與繼代保持方法，包括如下步驟：

(1)無菌幼胚的獲?。杭羧』ê?0～30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗滌劑的自來水中浸泡30min，沖洗干凈，自然晾干；將幼果用75％酒精浸泡30s，接著用0.1％升汞溶液滅菌15min，再用無菌水沖洗5次，最后將滅菌好的刺葡萄幼果，小心切開，取出完整的幼胚；

(2)啟動培養：取所述幼胚，將該幼胚以平放的方式接種至誘導愈傷組織的誘導培養基中，然后于培養室中黑暗條件下培養35天，得到初代愈傷組織；

(3)增殖培養：將初代愈傷組織轉接到繼代增殖培養基中，并于溫度23～25℃，光照強度1000～1500lx，每天光照10h的條件下進行繼代增殖培養，直至獲得生長一致且生長旺盛的刺葡萄愈傷組織；

(4)篩選：從步驟(3)所獲得的刺葡萄愈傷組織中，選取質地松脆、顏色為紫紅色的刺葡萄愈傷組織，剝去紫紅色表層，選取里層的愈傷組織接種至附加1.5mg/L2,4-D的MS固體培養基中，于溫度23～25℃，光照強度1000～1500lx，每天光照10h的條件下培養20～25天，獲得高產原花青素的愈傷組織；

(5)長期繼代保持：以培養20～25天的高產原花青素的愈傷組織為材料，于溫度23～25℃，光照強度1000～1500lx，每天光照10h的條件下，采用兩種繼代保持培養基交替繼代培養，并采用剝去所述愈傷組織紫紅色表層細胞，選里層愈傷組織接種的方式，能長期繼代保持高產原花青素的紫紅色刺葡萄愈傷組織。

進一步地，所述步驟(2)中的誘導培養基為：MS培養基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L，或MS培養基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。

進一步地，所述步驟(3)中的繼代增殖培養基為：MS培養基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L，或MS培養基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。

進一步地，所述步驟(5)中的兩種繼代保持培養基為：MS培養基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L，以及MS培養基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。