[發(fā)明專利]一種四溴雙酚A的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410317502.7
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104101702A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘魯青;胡豐曉;張輝;修蒙;劉童
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種四溴雙酚A含量的檢測方法，更具體的說是對四溴雙酚A的一種間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

四溴雙酚A(TBBPA)是目前使用最常見的一種溴系阻燃劑，被廣泛用作反應(yīng)型阻燃劑以制造含溴環(huán)氧樹脂和含溴聚碳酸酯以及作為中間體合成其他復(fù)雜的阻燃劑，也作為添加型阻燃劑用于ABS、HIPS、不飽和聚酯、硬質(zhì)聚氨酯泡沫塑料、膠黏劑以及涂料等。四溴雙酚A可以從產(chǎn)品中釋放到環(huán)境介質(zhì)中，隨著其大量使用，自然環(huán)境中四溴雙酚A的含量在迅速增加。目前，TBBPA在大氣，水體，土壤，生物體內(nèi)均已被檢出。研究表明，TBBPA是一種潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有潛在的持久性、細(xì)胞毒性、免疫毒性、甲狀腺素干擾性以及雌激素干擾性，尤其對水生生物產(chǎn)生嚴(yán)重毒害作用。TBBPA能夠通過飲用水或者生物富集以及食物鏈的方式積累到人體內(nèi)，從而危害到人類的健康。目前，挪威的PoHS禁令已從2008年起禁止在電子電氣類消費(fèi)品使用TBBPA。

常用的四溴雙酚A的分析方法有高效液相色譜法，氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法。由于這些分析方法樣品前處理復(fù)雜，且所需的儀器價格昂貴，檢測成本高，分析速度慢，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣品篩查。酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)特異性強(qiáng)、靈敏度高、價格低廉、快速簡便，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)色譜分析方法不足，已被大量應(yīng)用于環(huán)境中有機(jī)污染物的檢測，而目前國內(nèi)針對四溴雙酚A的ELISA檢測方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種四溴雙酚A的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，是一種具有高靈敏性和特異性的快速檢測方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

一種四溴雙酚A的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1)用四溴雙酚A合成人工抗原的步驟：

即首先將四溴雙酚A衍生化制成半抗原，再將所述的半抗原與BSA制備成偶聯(lián)物作為免疫抗原；然后將所述的四溴雙酚A半抗原與OVA制備成偶聯(lián)物，并將該偶聯(lián)物作為包被抗原；

具體的步驟是：

首先將四溴雙酚A衍生化制成半抗原。稱取四溴雙酚A半抗原、NHS和EDC各0.3mmol于燒杯中，加入3mL?DMSO溶解，磁力攪拌過夜。然后稱取0.12g?BSA或OVA，溶解在5mL0.1mol/L?NaHCO3(pH7.0)，得到BSA或OVA溶液。將含有四溴雙酚A半抗原的溶液加入BSA或OVA溶液中，邊攪拌邊緩慢滴加，反應(yīng)過夜，所得溶液4℃透析后冷凍干燥，-20℃保存。四溴雙酚A半抗原與BSA制備成的偶聯(lián)物為免疫抗原，四溴雙酚A半抗原與OVA制備的偶聯(lián)物為包被抗原；

2)四溴雙酚A多克隆抗體的制備步驟：

以四溴雙酚A與BSA的偶聯(lián)物為免疫抗原，免疫昆明大白鼠并利用現(xiàn)有的多克隆抗體制備與純化技術(shù)獲得四溴雙酚A多克隆抗體，該抗體可與四溴雙酚A特異性結(jié)合；

3)間接競爭ELISA檢測步驟：

利用棋盤滴定法對包被抗原和抗體工作濃度進(jìn)行篩選，選擇包被抗原濃度為10μg/mL，多克隆抗體稀釋度為1:2400，酶標(biāo)二抗(辣根過氧物酶標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(RAM-HRP))稀釋度為1:4000；

以0.05M的碳酸鹽緩沖液稀釋步驟1得到的包被抗原至10μg/mL，將稀釋后的包被抗原加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜；

將孵育過夜后的酶標(biāo)板甩干液體，然后加入200μL/孔洗滌液洗滌3次后，加入封閉液，所述的封閉液是含1％酪蛋白的上述0.05M的碳酸鹽緩沖液，37℃封閉2h；

用PBST將四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品溶液及待測樣品稀釋后，分別加入到各自的酶標(biāo)孔中，每孔加100μL；同時分別以抗體稀釋液(所述的抗體稀釋液是含1％酪蛋白的PBST溶液)以1:2400的比例稀釋步驟2得到的多克隆抗體，再加入酶標(biāo)板中，每孔100μL；37℃孵育30-60min后以PBST洗滌3次；

以抗體稀釋液1:4000的比例稀釋辣根過氧物酶標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(RAM-HRP)，然后加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃孵育30-60min后以PBST洗滌3次；

將四甲基聯(lián)苯胺顯色液A液和B液1:1混合后加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，37℃顯色20min；將加入2M硫酸溶液加入酶標(biāo)板中終止反應(yīng)，每孔50μL；

用酶標(biāo)儀在450nm波長下測吸光值OD₄₅₀，得到四溴雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及待測樣品的吸光值，將所得的待測樣品的吸光值與所做標(biāo)準(zhǔn)曲線對比可比算出待測樣品的四溴雙酚A含量。