[發明專利]一種四溴雙酚A的間接競爭酶聯免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201410317502.7
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104101702A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 潘魯青;胡豐曉;張輝;修蒙;劉童
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

1.一種四溴雙酚A的間接競爭酶聯免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1)用四溴雙酚A合成人工抗原的步驟：

即首先將四溴雙酚A衍生化制成半抗原，再將所述的半抗原與BSA制備成偶聯物作為免疫抗原；然后將所述的四溴雙酚A半抗原與OVA制備成偶聯物，并將該偶聯物作為包被抗原。

2)四溴雙酚A多克隆抗體的制備步驟：

以四溴雙酚A與BSA的偶聯物為免疫抗原，免疫昆明大白鼠并利用現有的多克隆抗體制備與純化技術獲得四溴雙酚A多克隆抗體，該抗體可與四溴雙酚A特異性結合；

3)間接競爭ELISA檢測步驟：

利用棋盤滴定法對包被抗原和抗體工作濃度進行篩選，選擇包被抗原濃度為10μg/mL，多克隆抗體稀釋度為1:2400，酶標二抗(辣根過氧物酶標記的兔抗大鼠IgG(RAM-HRP))稀釋度為1:4000；

以0.05M的碳酸鹽緩沖液稀釋步驟1得到的包被抗原至10μg/mL，將稀釋后的包被抗原加入酶標板中，每孔100μL，置于4℃冰箱內孵育過夜；

將孵育過夜后的酶標板甩干液體，然后加入200μL/孔洗滌液洗滌3次后，加入封閉液，所述的封閉液是含1％酪蛋白的上述0.05M的碳酸鹽緩沖液，37℃封閉2h；

用PBST將四溴雙酚A標準品溶液及待測樣品稀釋后，分別加入到各自的酶標孔中，每孔加100μL；同時分別以抗體稀釋液(所述的抗體稀釋液是含1％酪蛋白的PBST溶液)以1:2400的比例稀釋步驟2得到的多克隆抗體，再加入酶標板中，每孔100μL；37℃孵育30-60min后以PBST洗滌3次；

以抗體稀釋液1:4000的比例稀釋辣根過氧物酶標記的兔抗大鼠IgG(RAM-HRP)，然后加入酶標板中，每孔100μL，37℃孵育30-60min后以PBST洗滌3次；

將四甲基聯苯胺顯色液A液和B液1:1混合后加入酶標板中，每孔100μL，37℃顯色20min；將加入2M硫酸溶液加入酶標板中終止反應，每孔50μL；

用酶標儀在450nm波長下測吸光值OD₄₅₀，得到四溴雙酚A標準品溶液的標準曲線，以及待測樣品的吸光值，將所得的待測樣品的吸光值與所做標準曲線對比可比算出待測樣品的四溴雙酚A含量。

2.如權利要求1所述的四溴雙酚A的間接競爭酶聯免疫檢測方法，其特征在于上述步驟(1)的將四溴雙酚A衍生化制成半抗原之后的操作如下：稱取四溴雙酚A半抗原、NHS和EDC各0.3mmol于燒杯中，加入3mL?DMSO溶解，磁力攪拌過夜。然后稱取0.12g?BSA或OVA，溶解在5mL0.1mol/L?NaHCO3(pH7.0)，得到BSA或OVA溶液。將含有四溴雙酚A半抗原的溶液加入BSA或OVA溶液中，邊攪拌邊緩慢滴加，反應過夜，所得溶液4℃透析后冷凍干燥，-20℃保存。四溴雙酚A半抗原與BSA制備成的偶聯物為免疫抗原，四溴雙酚A半抗原與OVA制備的偶聯物為包被抗原。

3.如權利要求1所述的四溴雙酚A的間接競爭酶聯免疫檢測方法，其特征在于上述步驟2的四溴雙酚A多克隆抗體的具體制備方法如下：

選取4周齡的雌性昆明大白鼠作為實驗動物，實驗前暫養一周；將免疫抗原用生理鹽水稀釋至1mg/mL,然后與等量的弗氏佐劑混合用攪拌法使其乳化，乳化完全的標準是將一滴乳化過的溶液滴入水中呈現球型不分散，靜置后不出現油水分層；初次免疫將乳化好的抗原溶液于大鼠背部皮下多點注射，每只注射1mL；兩周后進行第一次加強免疫，免疫抗原用不完全弗氏佐劑乳化，注射部位和劑量與初次免疫相同；兩周后進行第二次加強免疫，生理鹽水稀釋抗原溶液，免疫部位為尾靜脈；一周后進行最后一次加強免疫，操作與第二次加強免疫相同；從耳緣靜脈采血，采用直接ELISA法測定抗體效價，確定抗體效價達到要求后采用摘眼球取血獲得抗血清，收集于滅菌離心管中。將此抗血清高速離心并過濾純化后于-20℃保存。

4.如權利要求3所述的四溴雙酚A的間接競爭酶聯免疫檢測方法，其特征在于所述的采用直接ELISA法測定抗體效價的步驟如下：

1)將步驟1的包被抗原用0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋，100μL/孔加入酶標孔中，置于4℃冰箱內過夜；次日取出酶標板，200μL/孔加入PBST洗滌液洗滌3次，每次搖床震蕩3min，甩去水分，在吸水紙上拍干；以下洗滌方法相同；

2)加封閉緩沖液200μL/孔封閉酶標板，37℃孵育2h；

3)將封閉緩沖液扣掉，洗滌酶標板三次；

4)將免疫過的大鼠的陽性血清稀釋成系列濃度加入酶標孔，100μL/孔，另一行加入等量的未經過免疫的大鼠的陰性血清，37℃孵育45min后洗滌，拍干；

5)抗體稀釋液以1：4000的比例稀釋酶標二抗(RAM-HRP)，然后100μL每孔加入酶標板中，37℃孵育45min后洗滌，拍干；

6)加入100μL?TMB顯色液(A液：B液的混合比例為1:1)，暗處靜置顯色反應20min后每孔加入100μL2M濃硫酸終止反應，用酶標儀測定450nm的吸光值(OD₄₅₀)，從而得到抗體效價。