[發(fā)明專利]用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410317450.3
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104126505A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫紅梅;張靜
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于球根花卉離體培養(yǎng)和遺傳育種研究領(lǐng)域，尤其涉及用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球繁育的體細(xì)胞胚離體再生技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

體細(xì)胞胚是一種由單細(xì)胞發(fā)育而成的胚狀體，采用這種方式繁殖具有取材少、遺傳穩(wěn)定性高、變異率低和再生率高等優(yōu)點(diǎn)，可有效減輕轉(zhuǎn)基因植株后期繁重的篩選工作，被認(rèn)為在基因工程、體細(xì)胞融合、細(xì)胞突變體誘導(dǎo)、人工種子制備、雜種合子胚挽救、種質(zhì)保存以及苗木快速繁殖等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景，已成為近年來遺傳轉(zhuǎn)化等基因工程方面研究的熱點(diǎn)。

細(xì)葉百合(Lilium?pumilumDC.?Fisch.)，別名山丹，是我國原產(chǎn)野生球根花卉，自然分布于東北、青海、陜西、寧夏等高寒地區(qū)，是分布最廣、分布緯度偏北的百合種之一，自然生長于陰坡疏林下。細(xì)葉百合抗性較強(qiáng)，耐鹽堿、耐寒、耐旱、耐陰，引種無須馴化，加之花色鮮紅、花型優(yōu)美，可直接應(yīng)用于家庭盆栽、庭院及城市園林綠化，是促成栽培的優(yōu)良植物材料。細(xì)葉百合鱗莖食用有滋陰、安神、潤肺的功效，莖、葉具有消炎止痛的作用。

然而細(xì)葉百合從種子繁殖到植株開花需要3年時間，種球生長周期長，近年來由于生態(tài)環(huán)境惡化和人為亂采濫挖現(xiàn)象嚴(yán)重，其原生種球自然分布量銳減，瀕臨滅絕。因此，細(xì)葉百合作為一種優(yōu)良的中國原產(chǎn)野生球根花卉，其種質(zhì)資源保存和種球繁殖迫在眉睫。此外，細(xì)葉百合植株莖稈較為細(xì)弱，觀賞性狀有待于進(jìn)一步改良。體細(xì)胞胚再生作為一種現(xiàn)代無性繁殖技術(shù)，是最有希望解決百合種球繁殖、優(yōu)質(zhì)種球培育、百合胚胎形態(tài)建成、組織分化以及植株再生等方面理論和實(shí)踐問題的重要技術(shù)領(lǐng)域。胚性愈傷組織是基因轉(zhuǎn)化的良好受體材料，誘導(dǎo)愈傷組織并長期保持其胚性狀態(tài)對基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的觀賞性狀改良及種質(zhì)創(chuàng)新意義深遠(yuǎn)。這一技術(shù)的應(yīng)用將對百合種質(zhì)保存、人工種子研制、突變體篩選、多倍體育種及轉(zhuǎn)基因育種等領(lǐng)域產(chǎn)生重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以細(xì)葉百合無菌苗葉片為外植體，誘導(dǎo)外植體脫分化形成胚性愈傷組織，經(jīng)過胚性比例調(diào)整和保存階段，獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%的胚性愈傷組織，在控制愈傷組織長期保持胚性狀態(tài)的基礎(chǔ)上有效保存胚性愈傷組織并誘導(dǎo)球形胚，獲得胚性比例高達(dá)100%、萌發(fā)率為0的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中1?cm³愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚。而在體細(xì)胞胚萌發(fā)階段，提高萌發(fā)率，促進(jìn)球形胚萌發(fā)，后經(jīng)歷類似合子胚的發(fā)育過程，最終成功獲得成熟萌發(fā)的體細(xì)胞胚，1?cm³胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細(xì)胞胚。從而為細(xì)葉百合的種球擴(kuò)繁和種質(zhì)保存提供高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚再生體系，并為基于轉(zhuǎn)基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供胚性愈傷組織這一優(yōu)良轉(zhuǎn)化受體。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，包括以下工藝步驟：

1.?外植體脫分化階段（非胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段）

選取小鱗莖直徑為1-1.2?cm的細(xì)葉百合無菌苗，將葉片切為長0.5?cm小段，正面向上、平鋪接種于脫分化培養(yǎng)基MS+BA?1.0?mg·L^-1+NAA?0.5?mg·L^-1（其中BA/NAA為2）中，光培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中含有蔗糖30?g·L^-1，瓊脂（條）7?g·L^-1?，pH?5.8，121℃高壓滅菌20?分鐘。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達(dá)80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強(qiáng)度為36?μmol·m^-2·s^-1；接種15天時，葉片、葉柄表層皺縮并形成細(xì)微的嫩黃色顆粒，后形成愈傷化。接種35天時，形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織。

2.?胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化階段（胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段）：在脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)第45天，將步驟1中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5?cm³小塊，轉(zhuǎn)接于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA?0.5?mg·L^-1+NAA?1.0?mg·L^-1（即BA/NAA為1/2）中，使非胚性愈傷組織插入培養(yǎng)基內(nèi)2-3?mm，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達(dá)80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強(qiáng)度為36?μmol·m^-2·s^-1。接種30天，在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織。