[發(fā)明專利]用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410317450.3
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104126505A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫紅梅;張靜
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

1.一種用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法，其特征是工藝步驟為：

⑴?外植體脫分化階段

將葉片切為長0.5?cm小段，正面向上、平鋪接種于脫分化培養(yǎng)基MS+BA?1.0?mg·L^-1+NAA?0.5?mg·L^-1中，光培養(yǎng)；該培養(yǎng)基中含有蔗糖30?g·L^-1，瓊脂（條）7?g·L^-1?，pH?5.8，121℃高壓滅菌20?分鐘。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1；接種15天時，葉片、葉柄表層皺縮并形成細(xì)微的嫩黃色顆粒，后形成愈傷化。接種35天時，形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織；

⑵?胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化階段

在脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)第45天，將步驟1中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5?cm³小塊，轉(zhuǎn)接于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA?0.5?mg·L^-1+NAA?1.0?mg·L^-1（即BA/NAA為1/2）中，使非胚性愈傷組織插入培養(yǎng)基內(nèi)2-3?mm，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1。接種30天，在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織；

⑶?胚性比例和顆粒性調(diào)整階段

經(jīng)步驟2培養(yǎng)45天，去除黃綠色非胚性愈傷組織部分，將亮黃色的胚性愈傷組織切為1?cm³小塊，轉(zhuǎn)接于胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基MS+NAA?0.5?mg·L^-1中，光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1。相同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1次后可獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織；

⑷?球形胚誘導(dǎo)階段

選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織，去除綠色非胚性愈傷組織和萌發(fā)的芽，依次交替使用胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA+NAA和胚性比例調(diào)整培養(yǎng)基MS+NAA，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%，每45天更換一次培養(yǎng)基，交替使用2次，可獲得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為0的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物，其中1?cm³愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚；

⑸?體細(xì)胞胚萌發(fā)和成苗階段

將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)于MS基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1。15-20天后，球形胚萌發(fā)，依次經(jīng)歷心形胚、盾形胚及子葉胚階段萌發(fā)形成成熟體細(xì)胞胚，1?cm³胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細(xì)胞胚。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法，其特征是：脫分化培養(yǎng)基為MS+BA?1.0?mg·L^-1+NAA?0.5?mg·L^-1。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法，其特征是：胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA?0.5?mg·L^-1+NAA?1.0?mg·L^-1。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法，其特征是：胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基為MS+NAA?0.5?mg·L^-1。