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[發明專利]用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法有效

專利信息
申請號: 201410317450.3 申請日: 2014-07-07
公開(公告)號: CN104126505A 公開(公告)日: 2014-11-05
發明(設計)人: 孫紅梅;張靜 申請(專利權)人: 沈陽農業大學
主分類號: A01H4/00 分類號: A01H4/00
代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101 代理人: 張述學
地址: 110866 遼*** 國省代碼: 遼寧;21
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 用于 百合 遺傳 轉化 種球快繁 體細胞 胚離體 再生 方法
【權利要求書】:

1.一種用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法,其特征是工藝步驟為:

⑴?外植體脫分化階段

將葉片切為長0.5?cm小段,正面向上、平鋪接種于脫分化培養基MS+BA?1.0?mg·L-1+NAA?0.5?mg·L-1中,光培養;該培養基中含有蔗糖30?g·L-1,瓊脂(條)7?g·L-1?,pH?5.8,121℃高壓滅菌20?分鐘。培養室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1;接種15天時,葉片、葉柄表層皺縮并形成細微的嫩黃色顆粒,后形成愈傷化。接種35天時,形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織;

⑵?胚性細胞轉化階段

在脫分化培養基中培養第45天,將步驟1中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5?cm3小塊,轉接于胚性愈傷組織誘導培養基MS+BA?0.5?mg·L-1+NAA?1.0?mg·L-1(即BA/NAA為1/2)中,使非胚性愈傷組織插入培養基內2-3?mm,光培養。培養室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1。接種30天,在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織;

⑶?胚性比例和顆粒性調整階段

經步驟2培養45天,去除黃綠色非胚性愈傷組織部分,將亮黃色的胚性愈傷組織切為1?cm3小塊,轉接于胚性愈傷組織調整培養基MS+NAA?0.5?mg·L-1中,光培養。培養室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1。相同培養基繼代培養1次后可獲得胚性比例高于90%、萌發率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織;

⑷?球形胚誘導階段

選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織,去除綠色非胚性愈傷組織和萌發的芽,依次交替使用胚性愈傷組織誘導培養基MS+BA+NAA和胚性比例調整培養基MS+NAA,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內濕度達80-90%,每45天更換一次培養基,交替使用2次,可獲得胚性比例高達100%、萌發率為0的良好胚性愈傷組織培養物,其中1?cm3愈傷組織培養物含有20個以上的球形胚;

⑸?體細胞胚萌發和成苗階段

將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養物轉于MS基本培養基中,培養室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1。15-20天后,球形胚萌發,依次經歷心形胚、盾形胚及子葉胚階段萌發形成成熟體細胞胚,1?cm3胚性愈傷組織培養物可形成超過21個體細胞胚。

2.?根據權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法,其特征是:脫分化培養基為MS+BA?1.0?mg·L-1+NAA?0.5?mg·L-1

3.?根據權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法,其特征是:胚性愈傷組織誘導培養基為MS+BA?0.5?mg·L-1+NAA?1.0?mg·L-1

4.?根據權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法,其特征是:胚性愈傷組織調整培養基為MS+NAA?0.5?mg·L-1

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