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[發(fā)明專利]用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法有效

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201410317450.3 申請日: 2014-07-07
公開(公告)號: CN104126505A 公開(公告)日: 2014-11-05
發(fā)明(設(shè)計)人: 孫紅梅;張靜 申請(專利權(quán))人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
主分類號: A01H4/00 分類號: A01H4/00
代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101 代理人: 張述學(xué)
地址: 110866 遼*** 國省代碼: 遼寧;21
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摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 用于 百合 遺傳 轉(zhuǎn)化 種球快繁 體細(xì)胞 胚離體 再生 方法
【權(quán)利要求書】:

1.一種用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法,其特征是工藝步驟為:

⑴?外植體脫分化階段

將葉片切為長0.5?cm小段,正面向上、平鋪接種于脫分化培養(yǎng)基MS+BA?1.0?mg·L-1+NAA?0.5?mg·L-1中,光培養(yǎng);該培養(yǎng)基中含有蔗糖30?g·L-1,瓊脂(條)7?g·L-1?,pH?5.8,121℃高壓滅菌20?分鐘。培養(yǎng)室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1;接種15天時,葉片、葉柄表層皺縮并形成細(xì)微的嫩黃色顆粒,后形成愈傷化。接種35天時,形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織;

⑵?胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化階段

在脫分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)第45天,將步驟1中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5?cm3小塊,轉(zhuǎn)接于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA?0.5?mg·L-1+NAA?1.0?mg·L-1(即BA/NAA為1/2)中,使非胚性愈傷組織插入培養(yǎng)基內(nèi)2-3?mm,光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1。接種30天,在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織;

⑶?胚性比例和顆粒性調(diào)整階段

經(jīng)步驟2培養(yǎng)45天,去除黃綠色非胚性愈傷組織部分,將亮黃色的胚性愈傷組織切為1?cm3小塊,轉(zhuǎn)接于胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基MS+NAA?0.5?mg·L-1中,光培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1。相同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1次后可獲得胚性比例高于90%、萌發(fā)率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織;

⑷?球形胚誘導(dǎo)階段

選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織,去除綠色非胚性愈傷組織和萌發(fā)的芽,依次交替使用胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA+NAA和胚性比例調(diào)整培養(yǎng)基MS+NAA,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%,每45天更換一次培養(yǎng)基,交替使用2次,可獲得胚性比例高達100%、萌發(fā)率為0的良好胚性愈傷組織培養(yǎng)物,其中1?cm3愈傷組織培養(yǎng)物含有20個以上的球形胚;

⑸?體細(xì)胞胚萌發(fā)和成苗階段

將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)于MS基本培養(yǎng)基中,培養(yǎng)室溫度為25±1℃,采用不透氣封口膜,保證組培瓶內(nèi)濕度達80-90%,每天16小時光照,8小時黑暗,光照強度為36?μmol·m-2·s-1。15-20天后,球形胚萌發(fā),依次經(jīng)歷心形胚、盾形胚及子葉胚階段萌發(fā)形成成熟體細(xì)胞胚,1?cm3胚性愈傷組織培養(yǎng)物可形成超過21個體細(xì)胞胚。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法,其特征是:脫分化培養(yǎng)基為MS+BA?1.0?mg·L-1+NAA?0.5?mg·L-1

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法,其特征是:胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA?0.5?mg·L-1+NAA?1.0?mg·L-1。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)葉百合遺傳轉(zhuǎn)化和種球快繁的體細(xì)胞胚離體再生方法,其特征是:胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基為MS+NAA?0.5?mg·L-1。

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