[發明專利]用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法

有效

• 申請號: 201410317450.3
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN104126505A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 孫紅梅;張靜
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 張述學

1.一種用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是工藝步驟為：

⑴?外植體脫分化階段

將葉片切為長0.5?cm小段，正面向上、平鋪接種于脫分化培養基MS+BA?1.0?mg·L^-1+NAA?0.5?mg·L^-1中，光培養；該培養基中含有蔗糖30?g·L^-1，瓊脂（條）7?g·L^-1?，pH?5.8，121℃高壓滅菌20?分鐘。培養室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1；接種15天時，葉片、葉柄表層皺縮并形成細微的嫩黃色顆粒，后形成愈傷化。接種35天時，形成黃綠色、晶瑩度大、濕度高、表面平滑的非胚性愈傷組織；

⑵?胚性細胞轉化階段

在脫分化培養基中培養第45天，將步驟1中外植體脫分化獲得的非胚性愈傷組織切為0.5?cm³小塊，轉接于胚性愈傷組織誘導培養基MS+BA?0.5?mg·L^-1+NAA?1.0?mg·L^-1（即BA/NAA為1/2）中，使非胚性愈傷組織插入培養基內2-3?mm，光培養。培養室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1。接種30天，在黃綠色非胚性愈傷組織表面形成亮黃色、顆粒性明顯的胚性愈傷組織；

⑶?胚性比例和顆粒性調整階段

經步驟2培養45天，去除黃綠色非胚性愈傷組織部分，將亮黃色的胚性愈傷組織切為1?cm³小塊，轉接于胚性愈傷組織調整培養基MS+NAA?0.5?mg·L^-1中，光培養。培養室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1。相同培養基繼代培養1次后可獲得胚性比例高于90%、萌發率低于5%、顆粒性良好的胚性愈傷組織；

⑷?球形胚誘導階段

選擇步驟3中獲得的胚性愈傷組織，去除綠色非胚性愈傷組織和萌發的芽，依次交替使用胚性愈傷組織誘導培養基MS+BA+NAA和胚性比例調整培養基MS+NAA，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每45天更換一次培養基，交替使用2次，可獲得胚性比例高達100%、萌發率為0的良好胚性愈傷組織培養物，其中1?cm³愈傷組織培養物含有20個以上的球形胚；

⑸?體細胞胚萌發和成苗階段

將步驟4中含有球形胚的胚性愈傷組織培養物轉于MS基本培養基中，培養室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內濕度達80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強度為36?μmol·m^-2·s^-1。15-20天后，球形胚萌發，依次經歷心形胚、盾形胚及子葉胚階段萌發形成成熟體細胞胚，1?cm³胚性愈傷組織培養物可形成超過21個體細胞胚。

2.?根據權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是：脫分化培養基為MS+BA?1.0?mg·L^-1+NAA?0.5?mg·L^-1。

3.?根據權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是：胚性愈傷組織誘導培養基為MS+BA?0.5?mg·L^-1+NAA?1.0?mg·L^-1。

4.?根據權利要求1所述的用于細葉百合遺傳轉化和種球快繁的體細胞胚離體再生方法，其特征是：胚性愈傷組織調整培養基為MS+NAA?0.5?mg·L^-1。