[發明專利]一種制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法

在審

• 申請號: 201410316245.5
• 申請日: 2014-07-04
• 公開（公告）號: CN104075922A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 聶志娟;賀子義;胡冰;顧若波;徐鋼春;杜富寬
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01Q30/20
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;曹翠珍

技術領域

本發明屬于寄生蟲電鏡樣品制備技術領域，特別涉及一種制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法。

背景技術

寄生蟲為一大群體，寄生于宿主的細胞、組織或腔道內，引起一系列的損傷，并引發各種的疾病，寄生蟲可因寄生環境的影響而發生形態構造變化，因此形態學觀察是研究寄生蟲的基礎和熱點。早期，應用光學顯微鏡等傳統形態學方法鑒定寄生蟲，隨著科技的進步和發展，掃描電子顯微鏡觀察已成為研究寄生蟲的形態結構是較為先進和常用的手段，對各部位的細微結構具有很高的辨別清晰度，比用光學顯微鏡進行蟲種鑒定更加準確可靠。1988年沈陽農業大學學報刊登的“寄生蟲掃描電鏡觀察樣品簡易制備法”,提供了一種寄生蟲掃描電鏡觀察樣品簡易制備法，該方法應用在寄生蟲掃描電鏡中存在的不足有：1）70%乙醇固定，固定效果差，且樣品采集固定后儲存時間短，不能較長時間保存；2）沒有用濾紙包裹，容易損失；3）直接70%固定脫水，沒有梯度緩慢脫水，寄生蟲易失水太快變形；4）100?%?乙醇中只有10分鐘，不能保障充分脫水，影響后期置換；5）CO₂做臨界點干燥，設備、醋酸異戊脂純度要求高，干燥過程中寄生蟲表面還是會產生不同程度的損傷褶皺，效果不是特別完美，易輕微變形，且成功率不高；6）真空鍍鋁膜，導電性一般。由于寄生蟲較多是軟體生物，形態較小，樣品制備過程中容易變形和丟失。為了適應寄生蟲掃描電鏡的要求，更好的顯露表面形態結構，在制樣過程中必須進行特殊處理，才能制備保持高度完整性和良好形態結構特征的寄生蟲掃描電鏡觀察樣品。目前這種處理的方法還不夠完善，因此需要進一步研究。

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發明內容

本發明的目的在于為了克服以上現有技術的不足而提供一種制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，為此我們探索了一種用環氧樹脂包埋法制備寄生蟲樣品的方法，利用此方法我們制備過大量的寄生蟲樣品，結果證明此方法制備寄生蟲不易變形，形態逼真，成功率較高，且能較長自然保存。

本發明是通過以下技術手段實現的：

一種制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，包括以下步驟：

步驟一，樣品前期處理：將寄生蟲活體迅速殺死后包裹于定性濾紙中；?

步驟二，樣品固定：將樣品置于戊二醛中固定2～4小時，然后使用PBS緩沖液將樣品表面清洗干凈，除去戊二醛，再用鋨酸固定，將寄生蟲熏成黑色；

步驟三，樣品清洗和梯度脫水：使用PBS緩沖液將樣品表面清洗干凈，除去鋨酸，然后用體積濃度為30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％、100％的丙酮作梯度脫水；

步驟四，置換：寄生蟲脫水后采用環氧樹脂包埋劑與丙酮的混合液中浸漬包埋；

步驟五，清洗：將環氧樹脂包埋劑浸漬后的寄生蟲挑出放到網眼小于寄生蟲體的篩網上，在70℃條件下聚合3～5小時，自然冷卻至室溫后用丙酮清洗，直到線蟲表面變為無光澤為止，再在70℃條件下聚合12～24小時；

步驟六，樣品鍍膜：將聚合好的樣品臺用離子濺射儀噴金90?~?120s，在寄生蟲樣品表面均勻鍍上一層導電的金膜，即完成寄生蟲掃描電鏡樣品的制備。

所述的制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，步驟一中活體寄生蟲可以在試管中于60℃、?3~5分鐘條件下迅速殺死。

所述的制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，步驟二中戊二醛的質量濃度可以為2％。

所述的制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，步驟二中鋨酸的質量濃度可以為1％。

所述的制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，步驟四中置換包埋可以為將寄生蟲充分脫水后轉入體積比為1:3的環氧樹脂包埋劑與丙酮的混合液中浸漬2小時，然后轉入體積比為1:1的環氧樹脂包埋劑與丙酮的混合液中浸漬4小時，再轉入體積比為3:1的環氧樹脂包埋劑與丙酮的混合液中浸漬6小時，最后轉入純環氧樹脂包埋劑中浸漬8~12小時。

以上所述的制備掃描電鏡用寄生蟲樣品的環氧樹脂包埋方法，其中所述的寄生蟲是：樣品相對較小，形態易變，體內無脊椎骨骼支撐的扁形動物門或者原生動物門。

本發明對寄生蟲樣品固定前處理，原理：1）寄生蟲生命力頑強，活體直接在2.5%戊二醛中固定，因應激掙扎蜷縮，對寄生蟲形態結構有較大影響，高溫迅速殺死寄生蟲，將易于保持寄生蟲正常形態；2）寄生蟲小，用定性濾紙包裹，易于減少因操作流程中樣品的丟失。環氧樹脂包埋劑浸漬置換包埋原理：環氧樹脂包埋劑易于與體內丙酮置換，為透射電鏡的常用包埋劑，硬度高，浸透容易。