[發明專利]一種基于熒光PCR技術檢測ESR1基因突變的方法

有效

• 申請號: 201410315487.2
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN104120178A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 戴鵬高;張潔;陳超;趙瑩;鄒暉
• 申請（專利權）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂

1.一種基于熒光PCR技術檢測ESR1基因突變的方法，用于非疾病診斷目的，包括以下環節：

(1)引物及熒光探針設計：

針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G這四種突變分別設計等位基因特異性引物，均作為上游引物，序列如下:

Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’

Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’

Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’

D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’

其中小寫字母表示的堿基為人為引入的錯配，以增強檢測的特異性；

針對四種突變設計一條共通的下游引物，序列如下:

Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’

針對四種突變設計一條共通的TaqMan熒光探針，其序列及修飾如下:

Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’

針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，作為內質控體系，其序列如下:

ALB?Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

ALB?Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

ALB?Probe(探針):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，FAM為6-carboxyfluorescein；HEX為6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2為Black?Hole?Quencher-2；

(2)模板的制備:提取待測樣本的基因組DNA；

(3)建立熒光實時定量PCR反應體系：

以反應體系總量為20μL計，在同一個反應體系中，分別加入Y537S等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特異性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特異性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan熒光探針100nM-250nM，以及ALB基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-250nM、2×Realtime?Mastermix10μL、待測樣本基因組DNA10-50ng，使用PCR等級的H₂O補足體積20μL；

(4)結果判定:

將配制好的反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增，根據儀器給出的ESR1基因與ALB基因的擴增指標(Ct值)，即FAM通道和HEX通道的擴增情況來進行結果判定。

2.根據權利要求1所述的基于熒光PCR技術檢測ESR1基因突變的方法，其特征在于，擴增過程參數為：

95℃，2～15min，不循環；

95℃，5～15sec；60℃，40-60sec；共計40個循環。

3.一種用于熒光PCR技術檢測ESR1基因突變的試劑盒，其特征在于：包括權利要求1中針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G這四種突變分別設計的上游引物、共通的下游引物、共通的TaqMan熒光探針以及作為內質控體系的另一特異性引物探針組合。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述作為內質控體系的另一特異性引物探針組合是針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，其序列如下:

ALB?Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

ALB?Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

ALB?Probe(探針):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：以試劑盒中的試劑總量20μL計，其中的Y537S等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特異性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特異性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan熒光探針100nM-250nM，以及ALB基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-250nM，2×Realtime?Mastermix10μL、PCR等級的H₂O補足體積。