[發(fā)明專利]一種基于熒光PCR技術(shù)檢測(cè)ESR1基因突變的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410315487.2
• 申請(qǐng)日: 2014-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN104120178A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴鵬高;張潔;陳超;趙瑩;鄒暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標(biāo)代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂(lè)

1.一種基于熒光PCR技術(shù)檢測(cè)ESR1基因突變的方法，用于非疾病診斷目的，包括以下環(huán)節(jié)：

(1)引物及熒光探針設(shè)計(jì)：

針對(duì)ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G這四種突變分別設(shè)計(jì)等位基因特異性引物，均作為上游引物，序列如下:

Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’

Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’

Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’

D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’

其中小寫字母表示的堿基為人為引入的錯(cuò)配，以增強(qiáng)檢測(cè)的特異性；

針對(duì)四種突變?cè)O(shè)計(jì)一條共通的下游引物，序列如下:

Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’

針對(duì)四種突變?cè)O(shè)計(jì)一條共通的TaqMan熒光探針，其序列及修飾如下:

Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’

針對(duì)ALB基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合，作為內(nèi)質(zhì)控體系，其序列如下:

ALB?Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

ALB?Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

ALB?Probe(探針):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，F(xiàn)AM為6-carboxyfluorescein；HEX為6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2為Black?Hole?Quencher-2；

(2)模板的制備:提取待測(cè)樣本的基因組DNA；

(3)建立熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：

以反應(yīng)體系總量為20μL計(jì)，在同一個(gè)反應(yīng)體系中，分別加入Y537S等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特異性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特異性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan熒光探針100nM-250nM，以及ALB基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-250nM、2×Realtime?Mastermix10μL、待測(cè)樣本基因組DNA10-50ng，使用PCR等級(jí)的H₂O補(bǔ)足體積20μL；

(4)結(jié)果判定:

將配制好的反應(yīng)體系在熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)儀器給出的ESR1基因與ALB基因的擴(kuò)增指標(biāo)(Ct值)，即FAM通道和HEX通道的擴(kuò)增情況來(lái)進(jìn)行結(jié)果判定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光PCR技術(shù)檢測(cè)ESR1基因突變的方法，其特征在于，擴(kuò)增過(guò)程參數(shù)為：

95℃，2～15min，不循環(huán)；

95℃，5～15sec；60℃，40-60sec；共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

3.一種用于熒光PCR技術(shù)檢測(cè)ESR1基因突變的試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1中針對(duì)ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G這四種突變分別設(shè)計(jì)的上游引物、共通的下游引物、共通的TaqMan熒光探針以及作為內(nèi)質(zhì)控體系的另一特異性引物探針組合。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述作為內(nèi)質(zhì)控體系的另一特異性引物探針組合是針對(duì)ALB基因設(shè)計(jì)的序列特異性引物探針組合，其序列如下:

ALB?Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

ALB?Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

ALB?Probe(探針):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：以試劑盒中的試劑總量20μL計(jì)，其中的Y537S等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特異性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特異性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特異性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan熒光探針100nM-250nM，以及ALB基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探針100nM-250nM，2×Realtime?Mastermix10μL、PCR等級(jí)的H₂O補(bǔ)足體積。